謝金水 陳小娜 毛 蓮 趙 青

廣東省東莞市第三人民醫(yī)院兒科，廣東東莞 523200

遺傳代謝病（inherited metabolic diseases，IMD）是由于組成機體正常代謝所需的酶、受體、載體及膜泵生物合成的多肽（蛋白）的編碼基因發(fā)生突變，導(dǎo)致機體代謝功能缺陷，而引起一系列臨床癥狀的一類遺傳病[1-2]。IMD 的病種繁多，其總體患病率在出生缺陷病中占有重要地位，危害嚴重，但通過早期篩查，及時診斷和治療可有效改善患兒預(yù)后[3-4]。以往臨床篩查IMD多依賴各項實驗室檢查，操作繁瑣、耗時且準確性有限[5]。隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，該技術(shù)通過不同同位素內(nèi)標，實現(xiàn)2 min 內(nèi)同時檢測同一樣品中多種目標代謝物，在IMD 篩查中得到了廣泛應(yīng)用[6]。串聯(lián)質(zhì)譜對IMD 的檢出率在不同地區(qū)中存在差異，我國上海地區(qū)、河北石家莊地區(qū)、廣西南寧地區(qū)等多地區(qū)已相繼報道應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜篩查新生兒或高危兒IMD[7]。但目前新疆喀什地區(qū)IMD 篩查工作尚未見報道。本研究應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對新疆喀什地區(qū)521 例IMD高危兒進行篩查，了解喀什地區(qū)IMD 的發(fā)病種類、發(fā)病年齡段和主要臨床表現(xiàn)，現(xiàn)報道如下：

1 對象與方法

1.1 研究對象

2017 年3 月～2018 年12 月新疆喀什地區(qū)疑似IMD 高危兒321 例，其中男173 例，女148 例，年齡24 h～12 歲，其中年齡24 h～＜1 個月98 例，1 個月～＜1 歲86 例，1～＜4 歲64 例，4～12 歲73 例。臨床主要表現(xiàn)為間斷抽搐或驚厥、肌張力異常、黃疸、肝功能異常、拒乳或厭食、呼吸困難、心功能異常、反復(fù)嘔吐、嗜睡等癥狀。本研究經(jīng)高危兒家長或監(jiān)護人同意，獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 樣本采集

采用干血紙片法進行樣本采集。采集受試兒手指或足跟血液滴于濾紙片上，形成直徑大于1 cm 的血斑，在室溫下自然干燥后，置于封口塑料袋內(nèi)，保存于-20℃冰箱。

1.3 同位素內(nèi)標

氨基酸內(nèi)標12 種和?；鈮A內(nèi)標8 種均購于美國劍橋公司，使用甲醇稀釋各同位素內(nèi)標至工作濃度，保存于4℃冰箱。氨基酸內(nèi)標2H4-丙氨酸（生產(chǎn)批號：20140622）、2H5-苯丙氨酸（生產(chǎn)批號：20170106）、2H3-谷氨酸（生產(chǎn)批號：20170319）、2H2-瓜氨酸（生產(chǎn)批號：20170414）、2H8-纈氨酸（生產(chǎn)批號：20170526）、2H3-亮氨酸（生產(chǎn)批號：20170703）、2H3-蛋氨酸（生產(chǎn)批號：20170130）、13C6-酪氨酸（生產(chǎn)批號：20170329）、2H3-天冬氨酸（生產(chǎn)批號：20170501）、2H2-鳥氨酸（生產(chǎn)批號：20170111）、2H4，13C-精氨酸（生產(chǎn)批號：20170207）的工作濃度均為2.5 μmol/L，15N,2-13C-甘氨酸（生產(chǎn)批號：20161227）的工作濃度為125 μmol/L。?；鈮A內(nèi)標2H3-乙酰肉堿（生產(chǎn)批號：20170127）和2H3-辛酰肉堿（生產(chǎn)批號：20170214）工作濃度為0.19 μmol/L，2H3-丙酰肉堿（生產(chǎn)批號：20170316）、2H3-丁酰肉堿（生產(chǎn)批號：20170328）、2H9-肉豆蔻酰肉堿（生產(chǎn)批號：20161207）和2H9-異戊酰肉堿（生產(chǎn)批號：20161224）工作濃度為0.04 μmol/L，2H9-游離肉堿（生產(chǎn)批號：20170426）工作濃度為0.76 μmol/L，2H9-2H3-棕櫚酰肉堿（生產(chǎn)批號：20170103）工作濃度為0.08 μmol/L。

1.4 方法

1.4.1 樣本處理方法 取樣本濾紙片，使用打孔器制成直徑3 mm 的圓形血片，放入96 孔過濾板（濾膜孔徑0.45 μm）中，每孔加入氨基酸同位素內(nèi)標和?；鈮A同位素內(nèi)標溶液各100 μL，室溫放置30 min 以洗脫血片中的氨基酸和?；鈮A。離心至新的96 孔聚丙烯板，使用50℃氮氣吹干，每孔加入3 mol/L 的鹽酸正丁醇溶液（由正丁醇和乙酰氯按9∶1 配制而成，正丁醇和乙酰氯均為色譜級，購于Millipore 公司，生產(chǎn)批號：17120601、17112407）60 μL，Teflon 膜覆蓋后，65℃恒溫箱內(nèi)放置15 min，然后50℃氮氣（純度99.999%）吹干，再加入80%乙腈（色譜級，Millipore 公司，生產(chǎn)批號：18012502）100 μL，鋁膜覆蓋后，使用API3000 型串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國ABI 公司）進行檢測。

1.4.2 檢測方法 流動相為80%乙腈，設(shè)置四元泵流速為30 μL/min，每次自動進樣量為20 μL。氨基酸掃描方法采用中性丟失掃描和多反應(yīng)檢測，中性氨基酸采用中性丟失掃描，丟失中性碎片質(zhì)荷比（m/z，即質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)的比值）為102Da，中性丟失掃描范圍為m/z 140～m/z 280；多反應(yīng)檢測用于甘氨酸、精氨酸、鳥氨酸、胍氨酸及其內(nèi)標檢測。?；鈮A檢測采用母離子掃描，掃描方式：子離子，m/z85；掃描范圍m/z 210～m/z 502。

1.4.3 資料分析及診斷 應(yīng)用軟件Chemo View1.2 進行定量分析，根據(jù)各種丁酰化的氨基酸和酰基肉堿的離子峰強度和已知濃度的同位素內(nèi)標，計算所測樣品中氨基酸和酰基肉堿的濃度。結(jié)合常規(guī)實驗室檢查和臨床表現(xiàn)，對串聯(lián)質(zhì)譜初篩陽性者，重新采血進行復(fù)查，若兩次篩查均為陽性，則該樣本IMD 篩查結(jié)果為陽性。

1.4.4 質(zhì)量控制 本研究參加美國疾病控制和預(yù)防中心IMD 篩查質(zhì)量評價，串聯(lián)質(zhì)譜儀操作人員、資料分析和診斷人員均接受專業(yè)培訓(xùn)，確保篩查結(jié)果準確性和可信性。

2 結(jié)果

2.1 IMD 高危兒篩查結(jié)果

321 例疑似IMD 高危兒，串聯(lián)質(zhì)譜檢測陽性17 例，總篩查陽性率為5.30%（17/321）。共涉及IMD 13 種。見表1。

2.2 IMD 陽性患兒發(fā)病年齡

17 例IMD 陽性患兒中，1 個月～1 歲發(fā)病率最高（8 例，47.06%），其次為24 h～＜1 個月（6 例，35.30%）、1 個月～＜4 歲（2 例，11.76%），4～12 歲發(fā)病率（1 例，5.88%）最低。

2.3 IMD 陽性患兒臨床表現(xiàn)

24 h～＜1 個月發(fā)病患兒主要臨床表現(xiàn)有間斷抽搐或驚厥、精神行為反應(yīng)、肌張力異常、嗜睡等；1 個月～＜4 歲發(fā)病患兒主要臨床表現(xiàn)有生長發(fā)育遲緩、喂養(yǎng)困難、黃疸、反復(fù)嘔吐等；4～12 歲發(fā)病患兒主要臨床表現(xiàn)有不明原因貧血、肝脾腫大等。見表2。

表1 篩查陽性的IMD 高危兒病種分布

表2 不同年齡段發(fā)病患兒臨床表現(xiàn)

3 討論

IMD 可累及神經(jīng)、腦部、肌肉、內(nèi)臟等全身多系統(tǒng)和器官，因其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，缺乏特異性癥狀體征，臨床診斷困難[8-10]。以往的酶學(xué)、基因測序等實驗室指標篩查方法，一次只能檢測一種疾病，難以滿足IMD 多病種、多范圍的篩查需求，且易誤診或漏診[11]。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是一種特異性和準確性更高的物質(zhì)定性、定量分析技術(shù)，其用于IMD 篩查，可同時測定IMD 高危兒血液中40 余種氨基酸、?；鈮A和游離肉堿的濃度變化，篩查出氨基酸代謝病、脂肪酸代謝病和有機酸代謝病等多種IMD，并利用已知同位素內(nèi)標對疾病作為鑒別診斷，具有較高的精密度和準確性[12-13]。

目前，中國多地區(qū)已經(jīng)普及串聯(lián)質(zhì)譜IMD 篩查方案，為IMD 預(yù)防和治療提供了可靠依據(jù)。串聯(lián)質(zhì)譜一次實驗可同時檢測出同一樣品的數(shù)十種遺傳代謝性疾病，本研究確診病例的13 種病種以氨基酸代謝病和脂肪酸代謝病為主，也有少數(shù)線粒體病病例。袁晃堆等[14]應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對廣東省東莞地區(qū)1206 例IMD 高危兒進行篩選，結(jié)果檢測到12 種IMD，總陽性檢出率為4.23%（51/1206）。茂名地區(qū)疑似高危兒篩查發(fā)現(xiàn)總陽性率為5.67%（206/3632），涉及IMD 7 種[15]。甘肅地區(qū)427 例高危樣本中陽性率為17.33%（74/427），共涉及8 種IMD[16]。本研究對喀什地區(qū)321 例高危兒篩查結(jié)果，17 例陽性患兒涉及IMD 13 種，總陽性率為5.30%，可見串聯(lián)質(zhì)譜篩查在不同地區(qū)具有不同差異。氨基酸代謝病可累及神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致患兒精神運動發(fā)育遲緩、智力減退等，適當(dāng)氨基酸補充，飲食控制維生素等綜合治療可改善該類病例的神經(jīng)癥狀[17]。脂肪酸代謝異?？衫奂靶呐K、肝臟，也可產(chǎn)生腦病變和肌肉病變，造成低血糖、嘔吐、嗜睡、生長遲緩等癥狀[18-19]，飲食中應(yīng)少量多餐，注意補充鏈脂肪酸、肉堿、核黃素等治療。

IMD 的病因包括先天基因遺傳和后天基因突變，發(fā)病期可覆蓋各個年齡段，以新生兒和嬰幼兒期最為常見。本研究結(jié)果，喀什地區(qū)IMD 以1 個月～1 歲（嬰幼兒期）發(fā)病率最高為47.06%，其次是24 h～＜1 個月（新生兒期）發(fā)病率為35.30%。24 h～＜1 個月發(fā)病患兒中表現(xiàn)為肌張力異常、間斷抽搐或驚厥、精神行為反應(yīng)差、嗜睡。1 個月～＜4 歲發(fā)病患兒表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩、喂養(yǎng)困難、黃疸、反復(fù)嘔吐、呼吸困難。4～12 歲發(fā)病患兒表現(xiàn)為不明原因貧血、肝脾腫大。IMD 若不及時治療會有死亡危險，近年來隨著IMD 篩查、診斷水平的提高及其發(fā)生病理生理機制的深入認識，在患兒首次發(fā)作時給予準確篩查、診斷，有助于早期采取有針對性的干預(yù)治療措施，使多數(shù)患兒度過危險期，降低患兒致殘率和死亡率。

綜上所述，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)用于IMD 篩查具有效率高、準確、可靠等優(yōu)勢。本研究不足之處在于篩查病例數(shù)量較少，未對陽性病例進行隨訪研究，下一步需繼續(xù)增加篩查數(shù)量深入分析喀什地區(qū)IMD 發(fā)病特點，進一步提高IMD 篩查效率，為預(yù)防和早期診治IMD，改善IMD 患兒預(yù)后提供參考。