謝金水 陳小娜 毛 蓮 趙 青

廣東省東莞市第三人民醫(yī)院兒科，廣東東莞 523200

遺傳代謝病（inherited metabolic diseases，IMD）是由于組成機體正常代謝所需的酶、受體、載體及膜泵生物合成的多肽（蛋白）的編碼基因發(fā)生突變，導(dǎo)致機體代謝功能缺陷，而引起一系列臨床癥狀的一類遺傳病[1-2]。IMD 的病種繁多，其總體患病率在出生缺陷病中占有重要地位，危害嚴重，但通過早期篩查，及時診斷和治療可有效改善患兒預(yù)后[3-4]。以往臨床篩查IMD多依賴各項實驗室檢查，操作繁瑣、耗時且準確性有限[5]。隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，該技術(shù)通過不同同位素內(nèi)標，實現(xiàn)2 min 內(nèi)同時檢測同一樣品中多種目標代謝物，在IMD 篩查中得到了廣泛應(yīng)用[6]。串聯(lián)質(zhì)譜對IMD 的檢出率在不同地區(qū)中存在差異，我國上海地區(qū)、河北石家莊地區(qū)、廣西南寧地區(qū)等多地區(qū)已相繼報道應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜篩查新生兒或高危兒IMD[7]。但目前新疆喀什地區(qū)IMD 篩查工作尚未見報道。本研究應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對新疆喀什地區(qū)521 例IMD高危兒進行篩查，了解喀什地區(qū)IMD 的發(fā)病種類、發(fā)病年齡段和主要臨床表現(xiàn)，現(xiàn)報道如下：

1 對象與方法

1.1 研究對象

2017 年3 月～2018 年12 月新疆喀什地區(qū)疑似IMD 高危兒321 例，其中男173 例，女148 例，年齡24 h～12 歲，其中年齡24 h～＜1 個月98 例，1 個月～＜1 歲86 例，1～＜4 歲64 例，4～12 歲73 例。臨床主要表現(xiàn)為間斷抽搐或驚厥、肌張力異常、黃疸、肝功能異常、拒乳或厭食、呼吸困難、心功能異常、反復(fù)嘔吐、嗜睡等癥狀。本研究經(jīng)高危兒家長或監(jiān)護人同意，獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 樣本采集

采用干血紙片法進行樣本采集。采集受試兒手指或足跟血液滴于濾紙片上，形成直徑大于1 cm 的血斑，在室溫下自然干燥后，置于封口塑料袋內(nèi)，保存于-20℃冰箱。

1.3 同位素內(nèi)標

氨基酸內(nèi)標12 種和?；鈮A內(nèi)標8 種均購于美國劍橋公司，使用甲醇稀釋各同位素內(nèi)標至工作濃度，保存于4℃冰箱。氨基酸內(nèi)標2H4-丙氨酸（生產(chǎn)批號：20140622）、2H5-苯丙氨酸（生產(chǎn)批號：20170106）、2H3-谷氨酸（生產(chǎn)批號：20170319）、2H2-瓜氨酸（生產(chǎn)批號：20170414）、2H8-纈氨酸（生產(chǎn)批號：20170526）、2H3-亮氨酸（生產(chǎn)批號：20170703）、2H3-蛋氨酸（生產(chǎn)批號：20170130）、13C6-酪氨酸（生產(chǎn)批號：20170329）、2H3-天冬氨酸（生產(chǎn)批號：20170501）、2H2-鳥氨酸（生產(chǎn)批號：20170111）、2H4，13C-精氨酸（生產(chǎn)批號：20170207）的工作濃度均為2.5 μmol/L，15N,2-13C-甘氨酸（生產(chǎn)批號：20161227）的工作濃度為125 μmol/L。酰基肉堿內(nèi)標2H3-乙酰肉堿（生產(chǎn)批號：20170127）和2H3-辛酰肉堿（生產(chǎn)批號：20170214）工作濃度為0.19 μmol/L，2H3-丙酰肉堿（生產(chǎn)批號：20170316）、2H3-丁酰肉堿（生產(chǎn)批號：20170328）、2H9-肉豆蔻酰肉堿（生產(chǎn)批號：20161207）和2H9-異戊酰肉堿（生產(chǎn)批號：20161224）工作濃度為0.04 μmol/L，2H9-游離肉堿（生產(chǎn)批號：20170426）工作濃度為0.76 μmol/L，2H9-2H3-棕櫚酰肉堿（生產(chǎn)批號：20170103）工作濃度為0.08 μmol/L。

1.4 方法

1.4.1 樣本處理方法 取樣本濾紙片，使用打孔器制成直徑3 mm 的圓形血片，放入96 孔過濾板（濾膜孔徑0.45 μm）中，每孔加入氨基酸同位素內(nèi)標和酰基肉堿同位素內(nèi)標溶液各100 μL，室溫放置30 min 以洗脫血片中的氨基酸和?；鈮A。離心至新的96 孔聚丙烯板，使用50℃氮氣吹干，每孔加入3 mol/L 的鹽酸正丁醇溶液（由正丁醇和乙酰氯按9∶1 配制而成，正丁醇和乙酰氯均為色譜級，購于Millipore 公司，生產(chǎn)批號：17120601、17112407）60 μL，Teflon 膜覆蓋后，65℃恒溫箱內(nèi)放置15 min，然后50℃氮氣（純度99.999%）吹干，再加入80%乙腈（色譜級，Millipore 公司，生產(chǎn)批號：18012502）100 μL，鋁膜覆蓋后，使用API3000 型串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國ABI 公司）進行檢測。

1.4.2 檢測方法 流動相為80%乙腈，設(shè)置四元泵流速為30 μL/min，每次自動進樣量為20 μL。氨基酸掃描方法采用中性丟失掃描和多反應(yīng)檢測，中性氨基酸采用中性丟失掃描，丟失中性碎片質(zhì)荷比（m/z，即質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)的比值）為102Da，中性丟失掃描范圍為m/z 140～m/z 280；多反應(yīng)檢測用于甘氨酸、精氨酸、鳥氨酸、胍氨酸及其內(nèi)標檢測。?；鈮A檢測采用母離子掃描，掃描方式：子離子，m/z85；掃描范圍m/z 210～m/z 502。

1.4.3 資料分析及診斷 應(yīng)用軟件Chemo View1.2 進行定量分析，根據(jù)各種丁?；陌被岷王；鈮A的離子峰強度和已知濃度的同位素內(nèi)標，計算所測樣品中氨基酸和?；鈮A的濃度。結(jié)合常規(guī)實驗室檢查和臨床表現(xiàn)，對串聯(lián)質(zhì)譜初篩陽性者，重新采血進行復(fù)查，若兩次篩查均為陽性，則該樣本IMD 篩查結(jié)果為陽性。

1.4.4 質(zhì)量控制 本研究參加美國疾病控制和預(yù)防中心IMD 篩查質(zhì)量評價，串聯(lián)質(zhì)譜儀操作人員、資料分析和診斷人員均接受專業(yè)培訓(xùn)，確保篩查結(jié)果準確性和可信性。

2 結(jié)果

2.1 IMD 高危兒篩查結(jié)果

321 例疑似IMD 高危兒，串聯(lián)質(zhì)譜檢測陽性17 例，總篩查陽性率為5.30%（17/321）。共涉及IMD 13 種。見表1。

2.2 IMD 陽性患兒發(fā)病年齡

17 例IMD 陽性患兒中，1 個月～1 歲發(fā)病率最高（8 例，47.06%），其次為24 h～＜1 個月（6 例，35.30%）、1 個月～＜4 歲（2 例，11.76%），4～12 歲發(fā)病率（1 例，5.88%）最低。

2.3 IMD 陽性患兒臨床表現(xiàn)

24 h～＜1 個月發(fā)病患兒主要臨床表現(xiàn)有間斷抽搐或驚厥、精神行為反應(yīng)、肌張力異常、嗜睡等；1 個月～＜4 歲發(fā)病患兒主要臨床表現(xiàn)有生長發(fā)育遲緩、喂養(yǎng)困難、黃疸、反復(fù)嘔吐等；4～12 歲發(fā)病患兒主要臨床表現(xiàn)有不明原因貧血、肝脾腫大等。見表2。

表1 篩查陽性的IMD 高危兒病種分布

表2 不同年齡段發(fā)病患兒臨床表現(xiàn)

3 討論

IMD 可累及神經(jīng)、腦部、肌肉、內(nèi)臟等全身多系統(tǒng)和器官，因其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，缺乏特異性癥狀體征，臨床診斷困難[8-10]。以往的酶學(xué)、基因測序等實驗室指標篩查方法，一次只能檢測一種疾病，難以滿足IMD 多病種、多范圍的篩查需求，且易誤診或漏診[11]。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是一種特異性和準確性更高的物質(zhì)定性、定量分析技術(shù)，其用于IMD 篩查，可同時測定IMD 高危兒血液中40 余種氨基酸、?；鈮A和游離肉堿的濃度變化，篩查出氨基酸代謝病、脂肪酸代謝病和有機酸代謝病等多種IMD，并利用已知同位素內(nèi)標對疾病作為鑒別診斷，具有較高的精密度和準確性[12-13]。

目前，中國多地區(qū)已經(jīng)普及串聯(lián)質(zhì)譜IMD 篩查方案，為IMD 預(yù)防和治療提供了可靠依據(jù)。串聯(lián)質(zhì)譜一次實驗可同時檢測出同一樣品的數(shù)十種遺傳代謝性疾病，本研究確診病例的13 種病種以氨基酸代謝病和脂肪酸代謝病為主，也有少數(shù)線粒體病病例。袁晃堆等[14]應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對廣東省東莞地區(qū)1206 例IMD 高危兒進行篩選，結(jié)果檢測到12 種IMD，總陽性檢出率為4.23%（51/1206）。茂名地區(qū)疑似高危兒篩查發(fā)現(xiàn)總陽性率為5.67%（206/3632），涉及IMD 7 種[15]。甘肅地區(qū)427 例高危樣本中陽性率為17.33%（74/427），共涉及8 種IMD[16]。本研究對喀什地區(qū)321 例高危兒篩查結(jié)果，17 例陽性患兒涉及IMD 13 種，總陽性率為5.30%，可見串聯(lián)質(zhì)譜篩查在不同地區(qū)具有不同差異。氨基酸代謝病可累及神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致患兒精神運動發(fā)育遲緩、智力減退等，適當氨基酸補充，飲食控制維生素等綜合治療可改善該類病例的神經(jīng)癥狀[17]。脂肪酸代謝異?？衫奂靶呐K、肝臟，也可產(chǎn)生腦病變和肌肉病變，造成低血糖、嘔吐、嗜睡、生長遲緩等癥狀[18-19]，飲食中應(yīng)少量多餐，注意補充鏈脂肪酸、肉堿、核黃素等治療。

IMD 的病因包括先天基因遺傳和后天基因突變，發(fā)病期可覆蓋各個年齡段，以新生兒和嬰幼兒期最為常見。本研究結(jié)果，喀什地區(qū)IMD 以1 個月～1 歲（嬰幼兒期）發(fā)病率最高為47.06%，其次是24 h～＜1 個月（新生兒期）發(fā)病率為35.30%。24 h～＜1 個月發(fā)病患兒中表現(xiàn)為肌張力異常、間斷抽搐或驚厥、精神行為反應(yīng)差、嗜睡。1 個月～＜4 歲發(fā)病患兒表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩、喂養(yǎng)困難、黃疸、反復(fù)嘔吐、呼吸困難。4～12 歲發(fā)病患兒表現(xiàn)為不明原因貧血、肝脾腫大。IMD 若不及時治療會有死亡危險，近年來隨著IMD 篩查、診斷水平的提高及其發(fā)生病理生理機制的深入認識，在患兒首次發(fā)作時給予準確篩查、診斷，有助于早期采取有針對性的干預(yù)治療措施，使多數(shù)患兒度過危險期，降低患兒致殘率和死亡率。

綜上所述，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)用于IMD 篩查具有效率高、準確、可靠等優(yōu)勢。本研究不足之處在于篩查病例數(shù)量較少，未對陽性病例進行隨訪研究，下一步需繼續(xù)增加篩查數(shù)量深入分析喀什地區(qū)IMD 發(fā)病特點，進一步提高IMD 篩查效率，為預(yù)防和早期診治IMD，改善IMD 患兒預(yù)后提供參考。