李 洋 費(fèi)洪新 張曉杰,3

1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154002；2.新余學(xué)院護(hù)理與康復(fù)學(xué)院，江西新余 338004；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是當(dāng)今社會(huì)普遍存在的老年嚴(yán)重性疾病，β-淀粉樣蛋白（βamyloid，Aβ）是其形成的重要因素[1-2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，炎癥小體NOD 樣受體蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）是AD 激活的危險(xiǎn)信號(hào)[3-4]。Aβ 可以刺激NLRP3，使小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，引起炎性反應(yīng)的發(fā)生[5-6]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于AD的治療還不夠完善，臨床用藥也有一定的毒副作用，但中醫(yī)藥方劑補(bǔ)腎益智方[7]、七福飲[8]、補(bǔ)陽還五湯[9]等卻為AD 的治療提供了有力的幫助。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的芪苓益腦湯（QYD）的基礎(chǔ)（專利號(hào)：ZL20151050 5180.3）上，通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3 的表達(dá)，從而探究QYD 對(duì)AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3 表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)3 月齡，雄性，體重（23±2）g，APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠（24 只）和同窩同性別的野生小鼠（8 只）均購自于南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院[SCXK（蘇）2015-0001]。所有小鼠按照清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)在溫度18～29℃、相對(duì)濕度達(dá)40%～70%、無菌、自由攝食飲水的條件下，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行飼養(yǎng)，小鼠灌胃、處死等基本操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)基本標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要藥品 鹽酸多奈哌齊（陜西方舟制藥有限公司，H20030583）。QYD 購買于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”），QYD 基本組成包括黃芪20 g（1712068S）、山慈菇8 g（160910）、昆布9 g（170501）、大棗10 g（SC11741018400042）、川芎6 g（1705027S）、桂枝6 g（1712070S）、三棱8 g（1507027C）、牡蠣20 g（170901）、知母10 g（1703107S）、土茯苓35 g（1703052S）、白術(shù)3 g（1707034CH）、甘草6 g（1712001），每付一共141 g，共購買10 付。組成QYD的中藥材由我院栗明副主任醫(yī)師按照《中國中藥材真?zhèn)舞b別圖典》[10]鑒定為正品后方可配伍使用，QYD 是由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥研究院將組成QYD 的中藥材經(jīng)過浸泡、煮沸、過濾、蒸發(fā)等過程，提取濃縮液，制成的水煎劑，該中藥組合物已經(jīng)申請(qǐng)并授權(quán)專利（專利號(hào)：ZL201510505180.3）。

1.1.3 試劑和儀器 Aβ 抗體（Abcam 公司，ab201060）；NLRP3 抗體（博士德公司，BA3677）；Trizol（碧云天公司，R0016）；HT7700 型透射電子顯微鏡（日立高新公司）；HH-11420-BS 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司）；DSX-280B 型手提式壓力蒸汽滅菌器（北京慧龍環(huán)科環(huán)境儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和給藥 24 只APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、QYD 實(shí)驗(yàn)組和多奈哌齊組，每組8 只，另設(shè)同窩同性別的8 只野生小鼠作為對(duì)照組。按體表面積和劑量換算[11]，QYD 實(shí)驗(yàn)組給予QYD（18.330 g/kg）、多奈哌齊組給予多奈哌齊（0.001 g/kg），模型組、對(duì)照組給予生理鹽水（2 mL/次），每天灌胃1 次，持續(xù)灌胃30 d。

1.2.2 行為學(xué)檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)定的基本條件包括水深20 cm，高于平臺(tái)1 cm，水溫控制在（23±2）℃，水池內(nèi)放適量奶粉，使其背景變?yōu)榘咨?，將平臺(tái)置于第4 象限，同時(shí)保持室內(nèi)外參照物一致。小鼠先進(jìn)行4 d 的訓(xùn)練測(cè)試，每次60 s。如果60 s 內(nèi)小鼠搜尋不到平臺(tái)則停留10 s。第5 天時(shí)進(jìn)行定位航行測(cè)試，觀察小鼠到達(dá)平臺(tái)的潛伏期，評(píng)價(jià)小鼠的學(xué)習(xí)能力；空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員移走平臺(tái)，將小鼠放入池中，讓它們自由游泳60 s，檢測(cè)小鼠到達(dá)平臺(tái)的游泳距離和穿越平臺(tái)的次數(shù)，以此評(píng)價(jià)小鼠的記憶能力。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 參考文獻(xiàn)[13-14]進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。透射電子顯微鏡觀察海馬區(qū)和小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化：將水迷宮測(cè)試后的小鼠置于超凈臺(tái)上，斷頸法取1 mm3的海馬組織塊，依次完成戊二醛固定，包埋等操作，制成50～70 nm 的超薄切片，電鏡觀察，拍照存儲(chǔ)圖像。

1.2.4 蛋白水平檢測(cè) 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NLRP3、Aβ 表達(dá)。行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，將小鼠解剖后斷頭取腦組織。依次完成固定，包埋，切片，脫蠟，脫水，修復(fù)，滴加封閉液，一抗工作液（4℃過夜）等操作，隨后辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗孵育，蘇木精復(fù)染。顯微鏡下觀察，存儲(chǔ)圖像。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算平均光密度值（MOD）。

1.2.5 基因水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）方法檢測(cè)NLRP3、Aβ 基因表達(dá)情況。取60 mg 腦組織，加600 μL 的Trizol 溶液，用研磨器迅速研磨，提取RNA。將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)設(shè)計(jì)特異性引物Aβ 引物（F：5′-CTGGAGGTGCCCACTGATG-3′ ；R：3′ -GGGTCTGACTCCCATTTTCC -5′ ）、NLRP3（F：5′-GAGCTGGACCTCAGTGACAATGC-3′；R：3′-ACCAATGCGAGATCCTGACAACAC-5′）、GAPDH（F：5′-CGTGCGTGACATCAAAGAGAA-3′；R：3′-AACCGCTCGTTGCCAATAGT-5′）。加入特殊SYBR GreenⅠ熒光材料，通過RT-qPCR 進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QYD 對(duì)AD 小鼠行為學(xué)的影響

與對(duì)照組比較，模型組AD 小鼠潛伏期明顯延長，游泳距離明顯增加，穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和QYD 組AD 小鼠潛伏期均明顯縮短，游泳距離明顯減少，穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 QYD 對(duì)AD 小鼠行為學(xué)的影響（，n=8）

表1 QYD 對(duì)AD 小鼠行為學(xué)的影響（，n=8）

注：與對(duì)照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。QYD：芪苓益腦湯；AD：阿爾茨海默病；“-”表示無數(shù)據(jù)

2.2 QYD 對(duì)AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

對(duì)照組小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)完整，胞體小且橢圓狀，細(xì)胞質(zhì)豐富，小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；模型組AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)形態(tài)較完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體絮狀變形，核固縮，有明顯脂褐素沉著，小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常；與模型組比較，多奈哌齊組和QYD 組AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，核固縮減輕，脂褐素少見，小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)。見圖1。

2.3 QYD 對(duì)AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3 和海馬Aβ表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組AD 小鼠NLRP3 在部分大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)明顯增多（P ＜0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和QYD 組AD 小鼠NLRP3 在部分大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)明顯減少（P ＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組AD 小鼠海馬區(qū)域Aβ 斑塊數(shù)量明顯增多（P ＜0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和QYD 組AD 小鼠海馬區(qū)域Aβ 斑塊數(shù)量明顯減少（P ＜0.05）。見表2、圖2～3。

圖1 腦組織內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)（TEM，18 000×）

圖2 各組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3 的表達(dá)（免疫組化，200×）

圖3 各組小鼠海馬內(nèi)Aβ 的表達(dá)（免疫組化，200×）

表2 QYD 對(duì)AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3和海馬Aβ 的影響（，n=8）

表2 QYD 對(duì)AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3和海馬Aβ 的影響（，n=8）

注：與對(duì)照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。QYD：芪苓益腦湯；AD：阿爾茨海默??；NLRP3：NOD 樣受體蛋白3；Aβ：β-淀粉樣蛋白；MOD：平均光密度值；“-”表示無數(shù)據(jù)

2.4 QYD 對(duì)AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3 和海馬Aβ mRNA 的影響

與對(duì)照組比較，模型組AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3和海馬Aβ mRNA 表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組、QYD 組AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3 和海馬Aβ mRNA 表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表3。

表3 QYD 對(duì)AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3和海馬Aβ mRNA 的影響（，n=8）

表3 QYD 對(duì)AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3和海馬Aβ mRNA 的影響（，n=8）

注：與對(duì)照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。QYD：芪苓益腦湯；AD：阿爾茨海默?。籒LRP3：NOD 樣受體蛋白3；Aβ：β-淀粉樣蛋白；“-”表示無數(shù)據(jù)

3 討論

AD 是一種常見的神經(jīng)退行性疾病[15-16]。最近在AD 模型小鼠中，出現(xiàn)了大量與AD 相關(guān)的信息，其中對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞特異性激活NLRP3 就有了新的研究[17]。被激活的NLRP3 炎癥小體能夠促進(jìn)APP/PS1 模型小鼠腦組織內(nèi)Aβ 沉積，NLRP3 炎癥小體的活化是炎性疾病發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)，抑制NLRP3 炎癥小體的活化可以對(duì)AD 疾病進(jìn)行有效的保護(hù)。因此本實(shí)驗(yàn)以APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，驗(yàn)證QYD 是否能夠降低NLRP3 的表達(dá)，從而驗(yàn)證QYD 是否能增強(qiáng)小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力。

資料顯示[18]，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以有效提高APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，當(dāng)歸補(bǔ)血湯與QYD 的君藥相同，QYD 是由當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的黃芪并配伍土茯苓等多種中藥成分組合而成，具有多靶點(diǎn)性，前期對(duì)QYD的研究也已經(jīng)證實(shí)了其對(duì)AD 的保護(hù)作用。本研究通過對(duì)AD 小鼠的水迷宮測(cè)試發(fā)現(xiàn)，QYD 可以改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，具有改善AD 小鼠的行為學(xué)的作用，同時(shí)由本實(shí)驗(yàn)的透射電子顯微鏡觀察結(jié)果可知，QYD 也具有改善AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用。研究表明，Aβ 及沉積物是導(dǎo)致NLRP3炎癥小體增多和AD 疾病發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[19-20]。炎癥小體現(xiàn)已經(jīng)成為近年來研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后釋放炎性因子也已成為研究熱點(diǎn)問題[21-24]。在AD 的疾病研究過程中，Aβ 通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞使其釋放炎癥小體NLRP3，從而使學(xué)習(xí)記憶能力喪失。通過實(shí)驗(yàn)研究可知，QYD 能夠有效地抑制AD 小鼠腦組織中的NLRP3 的表達(dá)，降低NLRP3 的活化水平。同時(shí)QYD 也可以減少小鼠腦組織內(nèi)Aβ 的沉積，因此，本研究可認(rèn)為NLRP3 的活化與Aβ 減少密切相關(guān)，NLRP3 的抑制可以在很大程度上保護(hù)AD 小鼠的記憶喪失和減少Aβ 沉積，QYD 作為抗炎藥物，為AD 的疾病治療提供了可靠的依據(jù)。

綜上所述，本研究提示QYD 能夠抑制NLRP3 活化，這與降低Aβ 沉積有關(guān)，驗(yàn)證了QYD 對(duì)AD 具有保護(hù)作用，這將為AD 的治療奠定基礎(chǔ)。