李 洋 費洪新 張曉杰,3

1.佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江佳木斯 154002；2.新余學院護理與康復(fù)學院，江西新余 338004；3.齊齊哈爾醫(yī)學院病理學院，黑龍江齊齊哈爾 161006

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是當今社會普遍存在的老年嚴重性疾病，β-淀粉樣蛋白（βamyloid，Aβ）是其形成的重要因素[1-2]。小膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞，炎癥小體NOD 樣受體蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）是AD 激活的危險信號[3-4]。Aβ 可以刺激NLRP3，使小膠質(zhì)細胞釋放炎癥介質(zhì)，引起炎性反應(yīng)的發(fā)生[5-6]。現(xiàn)代醫(yī)學對于AD的治療還不夠完善，臨床用藥也有一定的毒副作用，但中醫(yī)藥方劑補腎益智方[7]、七福飲[8]、補陽還五湯[9]等卻為AD 的治療提供了有力的幫助。本實驗在前期研究的芪苓益腦湯（QYD）的基礎(chǔ)（專利號：ZL20151050 5180.3）上，通過實驗檢測小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞NLRP3 的表達，從而探究QYD 對AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞NLRP3 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級3 月齡，雄性，體重（23±2）g，APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠（24 只）和同窩同性別的野生小鼠（8 只）均購自于南京大學南京生物醫(yī)藥研究院[SCXK（蘇）2015-0001]。所有小鼠按照清潔級標準在溫度18～29℃、相對濕度達40%～70%、無菌、自由攝食飲水的條件下，由齊齊哈爾醫(yī)學院動物實驗中心進行飼養(yǎng)，小鼠灌胃、處死等基本操作均符合動物倫理學基本標準。

1.1.2 主要藥品 鹽酸多奈哌齊（陜西方舟制藥有限公司，H20030583）。QYD 購買于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”），QYD 基本組成包括黃芪20 g（1712068S）、山慈菇8 g（160910）、昆布9 g（170501）、大棗10 g（SC11741018400042）、川芎6 g（1705027S）、桂枝6 g（1712070S）、三棱8 g（1507027C）、牡蠣20 g（170901）、知母10 g（1703107S）、土茯苓35 g（1703052S）、白術(shù)3 g（1707034CH）、甘草6 g（1712001），每付一共141 g，共購買10 付。組成QYD的中藥材由我院栗明副主任醫(yī)師按照《中國中藥材真?zhèn)舞b別圖典》[10]鑒定為正品后方可配伍使用，QYD 是由齊齊哈爾醫(yī)學院中醫(yī)藥研究院將組成QYD 的中藥材經(jīng)過浸泡、煮沸、過濾、蒸發(fā)等過程，提取濃縮液，制成的水煎劑，該中藥組合物已經(jīng)申請并授權(quán)專利（專利號：ZL201510505180.3）。

1.1.3 試劑和儀器 Aβ 抗體（Abcam 公司，ab201060）；NLRP3 抗體（博士德公司，BA3677）；Trizol（碧云天公司，R0016）；HT7700 型透射電子顯微鏡（日立高新公司）；HH-11420-BS 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海五久自動化設(shè)備有限公司）；DSX-280B 型手提式壓力蒸汽滅菌器（北京慧龍環(huán)科環(huán)境儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和給藥 24 只APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組、QYD 實驗組和多奈哌齊組，每組8 只，另設(shè)同窩同性別的8 只野生小鼠作為對照組。按體表面積和劑量換算[11]，QYD 實驗組給予QYD（18.330 g/kg）、多奈哌齊組給予多奈哌齊（0.001 g/kg），模型組、對照組給予生理鹽水（2 mL/次），每天灌胃1 次，持續(xù)灌胃30 d。

1.2.2 行為學檢測 參考文獻[12]進行行為學測試。Morris水迷宮實驗設(shè)定的基本條件包括水深20 cm，高于平臺1 cm，水溫控制在（23±2）℃，水池內(nèi)放適量奶粉，使其背景變?yōu)榘咨瑢⑵脚_置于第4 象限，同時保持室內(nèi)外參照物一致。小鼠先進行4 d 的訓(xùn)練測試，每次60 s。如果60 s 內(nèi)小鼠搜尋不到平臺則停留10 s。第5 天時進行定位航行測試，觀察小鼠到達平臺的潛伏期，評價小鼠的學習能力；空間探索實驗時，實驗人員移走平臺，將小鼠放入池中，讓它們自由游泳60 s，檢測小鼠到達平臺的游泳距離和穿越平臺的次數(shù)，以此評價小鼠的記憶能力。

1.2.3 形態(tài)學觀察 參考文獻[13-14]進行形態(tài)學觀察。透射電子顯微鏡觀察海馬區(qū)和小膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)變化：將水迷宮測試后的小鼠置于超凈臺上，斷頸法取1 mm3的海馬組織塊，依次完成戊二醛固定，包埋等操作，制成50～70 nm 的超薄切片，電鏡觀察，拍照存儲圖像。

1.2.4 蛋白水平檢測 免疫組織化學法檢測NLRP3、Aβ 表達。行為學檢測結(jié)束后，將小鼠解剖后斷頭取腦組織。依次完成固定，包埋，切片，脫蠟，脫水，修復(fù)，滴加封閉液，一抗工作液（4℃過夜）等操作，隨后辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗孵育，蘇木精復(fù)染。顯微鏡下觀察，存儲圖像。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件計算平均光密度值（MOD）。

1.2.5 基因水平檢測 采用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-qPCR）方法檢測NLRP3、Aβ 基因表達情況。取60 mg 腦組織，加600 μL 的Trizol 溶液，用研磨器迅速研磨，提取RNA。將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時設(shè)計特異性引物Aβ 引物（F：5′-CTGGAGGTGCCCACTGATG-3′ ；R：3′ -GGGTCTGACTCCCATTTTCC -5′ ）、NLRP3（F：5′-GAGCTGGACCTCAGTGACAATGC-3′；R：3′-ACCAATGCGAGATCCTGACAACAC-5′）、GAPDH（F：5′-CGTGCGTGACATCAAAGAGAA-3′；R：3′-AACCGCTCGTTGCCAATAGT-5′）。加入特殊SYBR GreenⅠ熒光材料，通過RT-qPCR 進行實時監(jiān)測得到實驗數(shù)據(jù)，所得實驗數(shù)據(jù)結(jié)果均采用2-ΔΔCt法計算。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 QYD 對AD 小鼠行為學的影響

與對照組比較，模型組AD 小鼠潛伏期明顯延長，游泳距離明顯增加，穿越平臺的次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和QYD 組AD 小鼠潛伏期均明顯縮短，游泳距離明顯減少，穿越平臺的次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 QYD 對AD 小鼠行為學的影響（，n=8）

表1 QYD 對AD 小鼠行為學的影響（，n=8）

注：與對照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。QYD：芪苓益腦湯；AD：阿爾茨海默?。弧?”表示無數(shù)據(jù)

2.2 QYD 對AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞的影響

對照組小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞形態(tài)完整，胞體小且橢圓狀，細胞質(zhì)豐富，小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)正常；模型組AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)形態(tài)較完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體絮狀變形，核固縮，有明顯脂褐素沉著，小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)異常；與模型組比較，多奈哌齊組和QYD 組AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞形態(tài)較規(guī)則，核固縮減輕，脂褐素少見，小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)。見圖1。

2.3 QYD 對AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3 和海馬Aβ表達的影響

與對照組比較，模型組AD 小鼠NLRP3 在部分大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞表達明顯增多（P ＜0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和QYD 組AD 小鼠NLRP3 在部分大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞的表達明顯減少（P ＜0.05）。與對照組比較，模型組AD 小鼠海馬區(qū)域Aβ 斑塊數(shù)量明顯增多（P ＜0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和QYD 組AD 小鼠海馬區(qū)域Aβ 斑塊數(shù)量明顯減少（P ＜0.05）。見表2、圖2～3。

圖1 腦組織內(nèi)小膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)（TEM，18 000×）

圖2 各組小鼠小膠質(zhì)細胞NLRP3 的表達（免疫組化，200×）

圖3 各組小鼠海馬內(nèi)Aβ 的表達（免疫組化，200×）

表2 QYD 對AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3和海馬Aβ 的影響（，n=8）

表2 QYD 對AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3和海馬Aβ 的影響（，n=8）

注：與對照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。QYD：芪苓益腦湯；AD：阿爾茨海默?。籒LRP3：NOD 樣受體蛋白3；Aβ：β-淀粉樣蛋白；MOD：平均光密度值；“-”表示無數(shù)據(jù)

2.4 QYD 對AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3 和海馬Aβ mRNA 的影響

與對照組比較，模型組AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3和海馬Aβ mRNA 表達均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組、QYD 組AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3 和海馬Aβ mRNA 表達均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表3。

表3 QYD 對AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3和海馬Aβ mRNA 的影響（，n=8）

表3 QYD 對AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NLRP3和海馬Aβ mRNA 的影響（，n=8）

注：與對照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。QYD：芪苓益腦湯；AD：阿爾茨海默?。籒LRP3：NOD 樣受體蛋白3；Aβ：β-淀粉樣蛋白；“-”表示無數(shù)據(jù)

3 討論

AD 是一種常見的神經(jīng)退行性疾病[15-16]。最近在AD 模型小鼠中，出現(xiàn)了大量與AD 相關(guān)的信息，其中對小膠質(zhì)細胞特異性激活NLRP3 就有了新的研究[17]。被激活的NLRP3 炎癥小體能夠促進APP/PS1 模型小鼠腦組織內(nèi)Aβ 沉積，NLRP3 炎癥小體的活化是炎性疾病發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)，抑制NLRP3 炎癥小體的活化可以對AD 疾病進行有效的保護。因此本實驗以APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，驗證QYD 是否能夠降低NLRP3 的表達，從而驗證QYD 是否能增強小鼠學習記憶的能力。

資料顯示[18]，當歸補血湯可以有效提高APP/PS1小鼠的學習記憶能力，當歸補血湯與QYD 的君藥相同，QYD 是由當歸補血湯中的黃芪并配伍土茯苓等多種中藥成分組合而成，具有多靶點性，前期對QYD的研究也已經(jīng)證實了其對AD 的保護作用。本研究通過對AD 小鼠的水迷宮測試發(fā)現(xiàn)，QYD 可以改善AD小鼠的學習記憶能力，具有改善AD 小鼠的行為學的作用，同時由本實驗的透射電子顯微鏡觀察結(jié)果可知，QYD 也具有改善AD 小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)的作用。研究表明，Aβ 及沉積物是導(dǎo)致NLRP3炎癥小體增多和AD 疾病發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[19-20]。炎癥小體現(xiàn)已經(jīng)成為近年來研究的熱點領(lǐng)域，小膠質(zhì)細胞激活后釋放炎性因子也已成為研究熱點問題[21-24]。在AD 的疾病研究過程中，Aβ 通過激活小膠質(zhì)細胞使其釋放炎癥小體NLRP3，從而使學習記憶能力喪失。通過實驗研究可知，QYD 能夠有效地抑制AD 小鼠腦組織中的NLRP3 的表達，降低NLRP3 的活化水平。同時QYD 也可以減少小鼠腦組織內(nèi)Aβ 的沉積，因此，本研究可認為NLRP3 的活化與Aβ 減少密切相關(guān)，NLRP3 的抑制可以在很大程度上保護AD 小鼠的記憶喪失和減少Aβ 沉積，QYD 作為抗炎藥物，為AD 的疾病治療提供了可靠的依據(jù)。

綜上所述，本研究提示QYD 能夠抑制NLRP3 活化，這與降低Aβ 沉積有關(guān)，驗證了QYD 對AD 具有保護作用，這將為AD 的治療奠定基礎(chǔ)。