郭思遠(yuǎn)，閆琦，李佳

首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069

東北雷公藤TripterygiumregeliiSpragus et Takeda系衛(wèi)矛科Celastraceae雷公藤屬植物，主要含有二萜類、三萜類、生物堿類等成分，具有免疫調(diào)節(jié)[1]、抗炎[2]、抗腫瘤[3]等作用。萜類化合物(如雷公藤紅素等)是東北雷公藤主要生物活性物質(zhì)之一[4]，其分子結(jié)構(gòu)以異戊二烯為基本單位，經(jīng)由甲羥戊酸(mevalonate，MVA)途徑和甲基赤蘚醇4-磷酸(methylerythritol 4-phosphate，MEP)途徑生物合成。研究表明[5]，HMGR和DXR分別是MVA途徑和MEP途徑的關(guān)鍵酶，其基因表達(dá)水平可直接影響植物萜類物質(zhì)的合成。

本研究克隆獲得TrDXR、TrHMGR基因全長(zhǎng)，并對(duì)其所編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，為鑒定TrDXR和TrHMGR基因功能、揭示雷公藤屬植物萜類物質(zhì)分子形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

東北雷公藤采自吉林通化，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)李佳教授鑒定為衛(wèi)矛科植物東北雷公藤TripterygiumregeliiSpragus et Takeda。取其根、莖洗凈后至于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 以CTAB法提取東北雷公藤根和莖混合總RNA，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。參照SMARTer RACE 5′/3′ kit試劑盒(日本TaKaRa公司)說(shuō)明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 東北雷公藤TrDXR、TrHMGR基因克隆 分析東北雷公藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選得到TrDXR基因2條，TrHMGR基因4條，經(jīng)分析其中1條TrDXR基因，1條TrHMGR基因?yàn)槿L(zhǎng)。使用ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線軟件對(duì)序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)分析，運(yùn)用Primer Premier 5.0 軟件在ORF兩端設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1)。引物序列委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 PCR引物

以東北雷公藤cDNA為模板進(jìn)行PCR，50 μL反應(yīng)體系包括：2×Phusion HF PCR Master Mix 25 μL，cDNA模板2 μL，正、反向引物各1.5 μL，ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后按DNA純化回收試劑盒(天根生物公司)說(shuō)明書純化回收，并與Trans pEASY-βzero克隆載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)約14 h，挑取陽(yáng)性單菌落于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)約6 h，菌液PCR無(wú)誤后送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 東北雷公藤TrDXR、TrHMGR基因生物信息學(xué)分析 使用SeqMan軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，使用Editseq軟件將測(cè)序正確的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列。使用ExPASy中ProtParam工具(http：//web.expasy.org/protparam)預(yù)測(cè)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量與理論等電點(diǎn)；TargetP 3.0 server(http：//www.cbs.dtu. dk/services/TargetP/)進(jìn)行信號(hào)肽分析；TRMHMM server v2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析；ProtComp Version 9.0(http：//www.softberry.com/berry.phtml)分析亞細(xì)胞定位；PRABI-GERLAND(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行三維模型預(yù)測(cè)。使用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中蛋白-蛋白BLAST工具進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，根據(jù)BLAST結(jié)果下載同源序列，使用DNAMAN進(jìn)行多重比對(duì)，并根據(jù)多重比對(duì)結(jié)果用MEGA 6.0軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄結(jié)果

取東北雷公藤混合總RNA進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(見(jiàn)圖1)，28 S和18 S條帶清晰完整。經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，總RNA質(zhì)量濃度為300～400 ng·μL-1，A260 nm/A280 nm介于2.0～2.2，A260 nm/A230 nm>1.8，符合實(shí)驗(yàn)要求，可進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。cDNA能擴(kuò)增出目的基因，說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄成功。

圖1 東北雷公藤總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 東北雷公藤TrDXR、TrHMGR基因克隆結(jié)果

取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(見(jiàn)圖2)，目的條帶在1500～2000 bp，與預(yù)期長(zhǎng)度一致。陽(yáng)性菌液測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列對(duì)比，序列相似度99%，表明克隆成功。TrDXR基因ORF區(qū)長(zhǎng)度為1410 bp，編碼氨基酸469個(gè)；TrHMGR基因ORF區(qū)長(zhǎng)度為1770 bp，編碼氨基酸589個(gè)。

注：1～2泳道對(duì)應(yīng)的基因?yàn)門rHMGR；3～4泳道對(duì)應(yīng)的基因?yàn)門rDXR。圖2 TrDXR、TrHMGR基因電泳圖

2.3 理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

TrDXR蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為51 126.87 kDa，理論等電點(diǎn)為5.94，為酸性蛋白。帶正電殘基為54，帶負(fù)電殘基為47；該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為41.37，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為97.76，親水性系數(shù)為-0.044，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白。TrHMGR蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為61 583.08 kDa，理論等電點(diǎn)為6.62，為酸性蛋白。帶正電殘基為57，帶負(fù)電殘基為56；該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為41.92，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為95.47，親水性系數(shù)為0.130，預(yù)測(cè)該蛋白為疏水性蛋白。半衰期體外預(yù)測(cè)，兩者均在哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中為30 h，在酵母菌中>20 h，在大腸桿菌中>10 h。

2.4 轉(zhuǎn)運(yùn)肽分析

TrDXR葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽得分為0.905、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽得分為0.078、分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)肽得分為0.017，其他得分為0.083，定位于葉綠體，RC為1。TrHMGR葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的分?jǐn)?shù)是0.001 1、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的分?jǐn)?shù)是0.472、分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)肽的分?jǐn)?shù)是0.047，其他的分?jǐn)?shù)是0.041 3，無(wú)定位，RC為5。因此初步認(rèn)定TrDXR存在轉(zhuǎn)運(yùn)肽，定位于葉綠體；TrHMGR不存在轉(zhuǎn)運(yùn)肽。

2.5 跨膜結(jié)構(gòu)域與亞細(xì)胞定位分析

跨膜結(jié)構(gòu)域分析顯示，TrDXR為膜外蛋白，不存在跨膜結(jié)構(gòu)；TrHMGR為跨膜蛋白，蛋白49～71和92～114氨基酸區(qū)域?yàn)榭缒そY(jié)構(gòu)區(qū)(見(jiàn)圖3)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，TrDXR定位于葉綠體，TrHMGR定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。研究認(rèn)為MEP途徑與MVA途徑分別定位于質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果與研究結(jié)果相符[6]。

注：A.TrDXR；B.TrHMGR。圖3 跨膜結(jié)構(gòu)域分析

2.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)分析

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，TrDXR蛋白α螺旋占39.02%，延伸鏈占11.30%，隨機(jī)卷曲占49.68%；TrHMGR蛋白α螺旋占42.67%，延伸鏈占2.67%，隨機(jī)卷曲占54.67%(見(jiàn)圖4)。三維模型預(yù)測(cè)分析顯示，TrDXR以1jvs.1.B蛋白為模板進(jìn)行同源建模，建模范圍為73～462位氨基酸，序列同源性為43.38%。TrDXR的N-端和C-端在空間結(jié)構(gòu)上折疊成V形，其內(nèi)部含有多個(gè)氨基酸殘基可與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和硫酸根離子(SULFATE ION)結(jié)合。TrHMGR以1dq 9.1.C蛋白為模板進(jìn)行同源建模，建模范圍為171～555位氨基酸，序列同源性為55.64%。TrHMGR含有4個(gè)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)結(jié)合域，由4個(gè)高度保守區(qū)域經(jīng)折疊后兩兩組成(見(jiàn)圖5)。

注：A.TrDXR；B.TrHMGR；藍(lán)色：α螺旋；紅色：延伸鏈；綠色：β轉(zhuǎn)角；紫色：無(wú)規(guī)則卷曲。圖4 TrDXR、TrHMGR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

注：A.TrDXR；B.TrHMGR。圖5 TrDXR、TrHMGR蛋白三維模型預(yù)測(cè)

2.7 多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

選取不同物種已表征功能的DXR和HMGR構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖6～7)，結(jié)果顯示TrDXR和TrHMGR編碼氨基酸分別與雷公藤DXR和HMGR聚類為一支，置信度高達(dá)100，親緣關(guān)系最近。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果選取親緣關(guān)系較近的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)(見(jiàn)圖8～9)，結(jié)果顯示TrDXR與同源蛋白序列一致性為92.44%，TrHMGR與同源蛋白序列一致性為88.22%。由此可見(jiàn)東北雷公藤DXR和HMGR與不同物種同源序列的相似性高，保守性強(qiáng)。TrDXR在其N-端含有2個(gè)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)結(jié)合功能域GSTGSIGT和LAAGSNV，在其肽鏈中間含有2個(gè)DXR活性位點(diǎn)PADSEHSAS和NKGLEVIEAHY；TrHMGR在其N-端含有2個(gè)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)結(jié)合功能域EMPVGYVQIP和TTEGCLVA，在其C-端含有2個(gè)NADPH結(jié)合功能域DAMGMNM和GTVGGGT。這些結(jié)合功能域和活性位點(diǎn)對(duì)植物DXR和HMGR功能至關(guān)重要，因此在進(jìn)化時(shí)高度保守。

圖6 TrDXR的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖7 TrHMGR的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖8 不同植物DXR氨基酸序列的多重比對(duì)

圖9 不同植物HMGR氨基酸序列的多重比對(duì)

3 討論

雷公藤甲素和雷公藤紅素等萜類化合物是雷公藤的主要活性成分，其在植物體內(nèi)主要由MEP途徑和MVA途徑進(jìn)行生物合成。HMGR和DXR分別是MVA途徑和MEP途徑的限速酶[7-8]，研究表明，過(guò)表達(dá)TwHMGR基因可使雷公藤懸浮細(xì)胞中雷公藤甲素和雷公藤紅素的含量顯著上升[9]，過(guò)表達(dá)TwHMGR基因和TwDXR基因可使雷公藤發(fā)狀根中雷公藤內(nèi)酯醇、雷公藤吉堿和雷公藤次堿的含量明顯升高[10]，而抑制雷公藤DXR基因的表達(dá)可使懸浮細(xì)胞中雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯醇含量下降[11]。由此可見(jiàn)，DXR和HMGR基因在調(diào)控雷公藤甲素、紅素等萜類物質(zhì)的生物合成中發(fā)揮著重要作用。但也有文獻(xiàn)指出，基因表達(dá)存在著復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制[12-13]，對(duì)途徑上游基因的調(diào)節(jié)能否專一性改變特定化合物的產(chǎn)量還有待進(jìn)一步研究[14]。

研究表明，雷公藤屬植物中均含有雷公藤甲素和雷公藤紅素[15]，且東北雷公藤根中雷公藤紅素的含量明顯高于其他兩個(gè)物種[16]。因此，本研究擬通過(guò)基因克隆及生物信息學(xué)分析初步探究東北雷公藤中萜類成分生物合成關(guān)鍵酶基因TrHMGR、TrDXR的生物功能，以挖掘更多具有相似功能的基因序列，豐富可用的基因資源。本研究獲得東北雷公藤DXR、HMGR基因各1條，并對(duì)其理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系及功能位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，為下一步鑒定基因功能打下基礎(chǔ)，為進(jìn)一步通過(guò)基因改良手段提高東北雷公藤中萜類成分含量、利用合成生物學(xué)策略異源高產(chǎn)雷公藤紅素甲素做出鋪墊。