王云云,梁林懷,華燕青,王 磊

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥物與化工分院，陜西 楊凌 712100；2.國(guó)家林業(yè)和草原局西北調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，陜西 西安 710000 ;3.楊凌綠海植物開(kāi)發(fā)有限公司,陜西 楊凌 712100)

青海省同德縣巴溝鄉(xiāng)然果村黃河干流的漫灘處有一片甘蒙檉柳“原始野生林地”。該處甘蒙檉柳樹(shù)齡大，樹(shù)形奇特，群落具有特殊的生物多樣性，對(duì)深入研究青藏高原乃至全球氣候變化有重要意義。該片甘蒙檉柳林處于黃河羊曲水電站庫(kù)區(qū)內(nèi)，水電站工程建成蓄水后將會(huì)淹沒(méi)該片檉柳林。通過(guò)該研究旨在探索甘蒙檉柳移植木在新環(huán)境下生長(zhǎng)的適應(yīng)性和生長(zhǎng)質(zhì)量，為甘蒙檉柳的移植和養(yǎng)護(hù)工作提供理論依據(jù)。

甘蒙檉柳(TamarixaustromongolicaNakai)為檉柳科(Tamaricaceae)檉柳屬(Tamarix)灌木或小喬木，為中國(guó)的特有種。為了保護(hù)該區(qū)域“原始野生林地”的甘蒙檉柳，青海黃河羊曲水電站庫(kù)區(qū)甘蒙檉柳移植保護(hù)項(xiàng)目組于2015年4月上旬至2016年4月對(duì)該區(qū)域內(nèi)的25株檉柳進(jìn)行了移植實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)30個(gè)月的精心養(yǎng)護(hù)，所移植的25株甘蒙檉柳生長(zhǎng)良好。為了深入研究移植對(duì)檉柳樹(shù)體內(nèi)化學(xué)成分生長(zhǎng)的影響情況，2018年10月在原生區(qū)和移植區(qū)分別采樣，利用超聲波提取法和鄰苯三酚自氧化法，對(duì)移植地和原生地甘蒙檉柳的主要成分黃酮的含量變化和抗氧化性變化進(jìn)行對(duì)比研究，從生物學(xué)角度來(lái)評(píng)判移植工作，為項(xiàng)目實(shí)施提供理論依據(jù)。

1 方法與材料

1.1 儀器

AR2140電子天平，RE-522AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SG2200HE超聲波(上海冠特超聲儀器有限公司)，UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津)，SHB-3T循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司)，酸度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

甘蒙檉柳樣品2018年10月27日分別采于海拔平均2 717 m的原生地(青海省同德縣巴溝鄉(xiāng)然果村北黃河干流東側(cè)漫灘地)和移植試驗(yàn)區(qū)(青海省同德縣巴溝鄉(xiāng)然果村東側(cè))。將原生地樣品1、2、3和移植地樣品1、2、3的枝、葉自然陰干后，分別粉碎過(guò)60目篩制粉待用。槲皮素(天津一方科技有限公司)，無(wú)水乙醇，正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、ALCL36H2O ，HCl，羥甲基氨基甲烷，連苯三酚，Na2EDTA均為分析純。

1.3 方法與結(jié)果

1.3.1 對(duì)照品溶液 精確稱取槲皮素對(duì)照品10 mg置于50 mL的容量瓶中，加入95%的乙醇溶解稀釋至刻度，質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的槲皮素對(duì)照品溶液備用。

1.3.2 顯色劑溶液 精稱AlCl3·6H2O固體 2.0059 g,用95%的乙醇溶解,再加3%的鹽酸4～5 mL,用95%乙醇于100 mL的容量瓶中定容。

1.3.3 供試品溶液的制備 取干燥檉柳枝葉粉碎，過(guò)60目篩，用50%乙醇超聲提取,提取條件為：固液比1∶15；100 W；40℃；40 min;3次，減壓濃縮得稠浸膏,懸浮于100 mL 水中,分別用石油醚(60～90℃)、醋酸乙酯和正丁醇萃取，將各萃取液分別減壓濃縮，得石油醚層、乙酸乙酯層和正丁醇層，分別干燥得干燥粉末。以此為黃酮供試樣品。取0.5 g樣品粉末,用75%的乙醇溶解，定溶于50 mL容量瓶中，搖勻，用0.22 μm超濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液用UV測(cè)定含量。

1.3.4 最佳吸收波長(zhǎng)的確定 取1 mL 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，置容量瓶中，加入5 mL的顯色劑，靜置顯色20 min。同時(shí)作兩個(gè)空白溶液，取1 mL乙醇加5 mL顯色劑，靜置20 min，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)。槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液在427 nm 處有最大吸收峰，且無(wú)干擾，故選取此波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外光譜

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 移取0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL的容量瓶中,加顯色劑5.2 mL、5.0 mL 、4.8 mL、4.6 mL 、4.4 mL搖勻，并做陰性對(duì)照一個(gè)。靜置顯色20 min。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)427 nm 處測(cè)吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 抗氧化活性測(cè)定 配制 0.1 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷溶液;0.101 mol·L-1HCl溶液; 0.050.1 mol·L-1,pH=7.4,含1 m 0.1 mol·L-1的Na2EDTA Tris-HCl緩沖液； 60 mmol·L-1連苯三酚溶液后，取11.8 mL Tris-HCl緩沖液，加入石英比色皿中，再加約0.2 mL連苯三酚溶液，快速混合，于325 nm處測(cè)其吸光度A325nm,30，隔30秒讀數(shù)一次吸光度A值 ，至300 s止。得A325nm,300的吸光度,△A0= A325nm,300-A325nm,30。取各供試樣品續(xù)濾液2 mL，加入到大石英比色皿中，再加9.8 mL Tris-HCl緩沖液，再加0.2 mL連苯三酚溶液，混合后測(cè)定各樣品A325nm,30，每30 s讀吸光度一次，至 300 s時(shí)為止得A325nm,300。ΔA樣=A325nm,300- A325nm,30。自由基清除率=(△A0-△A樣)/ △A0* 100

2 結(jié)果與討論2.1 繪制槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可知當(dāng)槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品含量在12.00～27.50 mg·mL-1范圍內(nèi)，與吸光度呈良好的線性關(guān)系。回歸方程C=11.9263 *A -0.1209 ，r=0.999741。

圖2 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度試驗(yàn)

取同一槲皮素對(duì)照品溶液，在波長(zhǎng)427 nm處連續(xù)測(cè)定5次。結(jié)果吸光度均值為0.59093，RSD=0.2687%，表明該方法精密度良好。

2.3重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取干樣品5份，分別進(jìn)行超聲提取，照1.3.3項(xiàng)制備5份供試品溶液，于427 nm處測(cè)定吸光度值，總黃酮平均值0.8069 mg·g-1, RSD=1.0213%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液一份，對(duì)照剛做的測(cè)定值，分別在0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h測(cè)定該樣品的吸光度,結(jié)果顯示吸光度RSD=1.0031%說(shuō)明樣品在顯色后2.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

在已知含量標(biāo)準(zhǔn)品的樣品溶液中加入一定的槲皮素對(duì)照品溶液后進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 黃酮含量測(cè)定

取原生地和移植地檉柳樣品干粉各15 g用50%乙醇超聲提取,條件為固液比1∶15；100W；40℃；40 min;3次。減壓濃縮得稠浸膏,懸浮于100 mL 水中,分別用石油醚(60～90℃)、醋酸乙酯和正丁醇萃取，將各萃取液分別減壓濃縮，得石油醚層、乙酸乙酯層和正丁醇層浸膏。分別干燥得干燥粉末見(jiàn)表2。以此為黃酮樣品。取一定量樣品75%的乙醇溶解，定溶于50 mL容量瓶中，搖勻，用超濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液為樣品溶液。取續(xù)濾液1 mL置于試管中加5 mL的顯色劑靜置20 min，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表3，比較見(jiàn)圖3，圖4，圖5和圖6。

表1 加標(biāo)回收率

表2 取樣量及超聲提取干粉量

表3 樣品中黃酮含量

圖3 樣品中槲皮素含量 圖4 石油醚層槲皮素含量

圖5 乙酸乙酯層槲皮素含量 圖6 正丁醇萃層槲皮素含量

表4 自由基清除率

2.7 抗氧化活性測(cè)定

取2.6項(xiàng)下的各樣品續(xù)濾液2 mL，加入大石英比色皿中，加9.8 mL Tris-HCL緩沖液，加0.2 mL連苯三酚溶液，迅速混合在325 nm處測(cè)定吸光度，每30 s讀數(shù)一次，至300 s為止。ΔA樣=A325nm,300- A325nm,30。各樣品黃酮的自由基清除率見(jiàn)表4。清除率=(△A0-△A樣)/ △A0* 100。

3 結(jié)論

從圖3～圖6 可見(jiàn)，移植組正丁醇萃取層總黃酮含量較原生組高，各樣品間黃酮含量均勻差異較??；石油醚層黃酮含量為：移植組較原生組低，但移植組樣品之間黃酮含量差異較小，說(shuō)明檉柳移植后水分、土壤、環(huán)境適宜檉柳生存，長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定。乙酸乙酯層中黃酮原生組含量高于移植組，但移植2的含量高于原生組，說(shuō)明乙酸乙酯層中黃酮類組分受環(huán)境因素影響較大，這種影響隨個(gè)體差異，適應(yīng)性好的個(gè)體不受影響。從表4可見(jiàn)，檉柳中黃酮具有較強(qiáng)的抗氧性。移植組黃酮含量雖然較原生組低，但樣品移植1和移植2的抗氧值高于原生組。說(shuō)明移植對(duì)黃酮的含量有影響，而對(duì)黃酮的抗氧化性不但沒(méi)有影響，而且還有利于其抗氧性的積累。

檉柳在移植前對(duì)枝條、根系進(jìn)行了較大的修剪處理，導(dǎo)致樹(shù)體枝葉的光合作用能力降低，根系的營(yíng)養(yǎng)吸收活動(dòng)減弱，致使移植體的整體生長(zhǎng)緩慢，整體黃酮含量較原生組低。但是移植組的正丁醇層和石油醚層中黃酮含量較原生組穩(wěn)定，說(shuō)明檉柳在緩慢的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)下，體內(nèi)黃酮的蓄積是比較平穩(wěn)的，且黃酮的抗氧性還在增加，由此說(shuō)明移植后的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)平穩(wěn)，移植是成功的。