唐克峰 沈國松 李 志 婁志武

大前庭導(dǎo)水管綜合征（larged vestibular aqueduct syndrome，LVAS）是一種以前庭水管擴(kuò)大伴有感音神經(jīng)性聾為特征的常染色體隱性遺傳性非綜合征型聽力障礙疾病，其發(fā)病與SLC26A4 基因密切相關(guān)[1]。SLC26A4 基因位于7q31，含有21 個(gè)外顯子，開放閱讀框架2343bp，每個(gè)內(nèi)含子與外顯子的界線分明，SLC26A4 基因編碼一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能都十分復(fù)雜的蛋白質(zhì)Pendrin[2]。該蛋白由780 個(gè)氨基酸組成，主要表達(dá)于內(nèi)耳的內(nèi)淋巴管和淋巴囊，介導(dǎo)OH-、I-、Cl-和HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)，維持內(nèi)淋巴液的離子平衡，對內(nèi)耳內(nèi)淋巴液再吸收具有不可或缺的作用[3]。SLC26A4 基因的突變譜很廣泛，目前世界范圍內(nèi)約有240 種以上的突變報(bào)道與耳聾相關(guān)[4]。本研究中，筆者對1 對大前庭導(dǎo)水管綜合征聽障育齡夫婦應(yīng)用目標(biāo)區(qū)域捕獲測序技術(shù)對聽力障礙相關(guān)基因進(jìn)行突變檢測，明確其突變類型和突變形式，并探討其遺傳風(fēng)險(xiǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 丈夫30 歲，妻子29 歲，夫妻自訴出生時(shí)無異常，無耳毒性藥物應(yīng)用史，無外傷史，皆為2歲前出現(xiàn)對聲音反應(yīng)差，男方不能言語至今，女方可發(fā)出少量分辨不清晰言語。聽力學(xué)檢測皆示雙耳重度感音神經(jīng)性聾，夫妻雙方MRI 檢查結(jié)果皆顯示雙側(cè)內(nèi)淋巴囊擴(kuò)大，提示大前庭導(dǎo)水管綜合征（見圖1）。?？茩z查：夫妻雙方雙側(cè)耳廓未見畸形，外耳道及鼓膜未見明顯異常。男方父母及姐姐為聾啞人，但均拒絕基因檢測；女方為領(lǐng)養(yǎng)兒，家系成員情況不詳。另外選取100 名在我院做耳聾基因篩查聽力正常且無聽力障礙家族史的兒童作為正常對照組，均進(jìn)行SLC26A4 基因60 個(gè)突變位點(diǎn)的檢測。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過（批號2013-007），研究對象均已簽署知情同意書。

圖1 大前庭導(dǎo)水管顳骨MRI 示意圖（A：男性；B：女性）

1.2 方 法

1.2.1 DNA 提取 應(yīng)用DNA 提取試劑盒（廈門致善生物公司，貨號603003，批號190614）提取所有耳聾患者的基因組DNA，利用紫外分光光度計(jì)測量待檢DNA 濃度及純度，取一定量的DNA 原液稀釋成20ng/μL 的工作濃度，-20℃保存?zhèn)溆?，DNA 原液-70℃保存。

1.2.2 文庫構(gòu)建及測序 使用Aligent SureSelect 方法制備檢測樣本，實(shí)驗(yàn)方法遵照操作手冊，實(shí)驗(yàn)包括DNA 片段化處理、末端修復(fù)、加接頭、PCR 擴(kuò)增、探針雜交、磁珠捕獲富集等步驟。文庫經(jīng)2200 生物分析儀（Agilent）質(zhì)控分析合格后上機(jī)測序。采用Illumina HiSeq X-Ten 系統(tǒng)完成高通量測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用FastQC 軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析；利用BWA 軟件（v0.7.15-r1140）將所有過濾后的測序序列（reads）比對到參考基因組（GRCh37/hg19）；利用Picard 軟件工具去除重復(fù)reads；利用GATK 軟件工具包（v3.7-0）完成單堿基變異（SNV）和插入缺失變異（Indel）的檢出；利用Annovar 及VEP 等軟件包進(jìn)行注釋。

1.2.4 致病性變異過濾及篩選 結(jié)合人群基因變異數(shù)據(jù)庫[dbSNP 數(shù)據(jù)庫（SNP150）、千人基因組數(shù)據(jù)庫等]信息，去除MAF＞0.01（AD）或MAF＞0.05（AR）的高頻變異。參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相關(guān)指南，結(jié)合疾病基因變異數(shù)據(jù)庫（Clinvar、HGMD 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫）信息、文獻(xiàn)報(bào)道、功能試驗(yàn)、遺傳模式、基因型-表型關(guān)聯(lián)分析、預(yù)測軟件（mcap、REVEL 及CADD 等）預(yù)測結(jié)果等綜合判斷，將變異分成5 類：致病、可能致病、意義不明確、可能良性、良性；并篩選出與先證者表型相關(guān)的可疑致病性變異進(jìn)行Sanger 測序驗(yàn)證等進(jìn)一步分析。

1.2.5 Sanger 測序驗(yàn)證及共分離分析 通過以上方法篩選出的可疑致病基因變異，利用Primer3 軟件設(shè)計(jì)PCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增（PCR 引物由中翰金諾醫(yī)學(xué)研究所設(shè)計(jì)，華大基因合成，見表1）及Sanger 測序分析。利用Mutation Surveyor 等軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 PCR 引物序列

2 結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)男方為SLC26A4c.230A ＞T、c.1174A＞T 和c.1547dupC 的復(fù)合雜合突變，Sanger 測序示意圖分別如圖2 所示。女方為SLC26A4c.919-2A＞G 和c.1547dupC 的復(fù)合雜合突變，Sanger測序示意圖分別如圖3 所示。而正常對照組100名檢測對象里SLC26A4 基因60 個(gè)位點(diǎn)未見任何突變。

圖2 本例聾啞夫婦男性的SLC26A4 基因突變位點(diǎn)Sanger測序結(jié)果

圖3 本例聾啞夫婦女性的SLC26A4 基因突變位點(diǎn)Sanger 測序結(jié)果

3 討論

20 世紀(jì)70 年代末隨著CT 問世，LVAS 逐漸被認(rèn)識(shí)，它是遺傳性耳聾患兒中最常見的一種內(nèi)耳發(fā)育畸形性疾病，也是一種常染色體隱性遺傳性聽力障礙性疾病[5]。其主要表現(xiàn)為雙側(cè)進(jìn)行性感音神經(jīng)性耳聾，影像學(xué)CT 或MRI 提示內(nèi)淋巴囊或前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大[6]?；疾€(gè)體間聽力損傷程度差別較大，聽力范圍從完全正常到極重度聽力障礙不等，咳嗽、頭部倒立、用力擤鼻涕以及劇烈體育運(yùn)動(dòng)等都可以造成聽力損傷。早期臨床診斷或者基因診斷，結(jié)合正確的防護(hù)措施，有助于保護(hù)患者的聽力，甚至能夠完全正常生存，提高生活質(zhì)量。

中國耳聾高發(fā)與中國人群常見耳聾基因突變的高攜帶率息息相關(guān)，其中SLC26A4 基因突變的攜帶率高達(dá)2%～3%，約80%LVAS 患者中可見SLC26A4突變[7]。再加上因?yàn)樯鐣?huì)原因，耳聾患者結(jié)為夫婦的概率大大增加。由于其耳聾基因攜帶率高，遺傳性耳聾比例高，從而導(dǎo)致生育后代耳聾概率大大高于普通婚配夫婦，因此耳聾夫婦成為高危人群應(yīng)該受到重點(diǎn)預(yù)防和干預(yù)。

有研究報(bào)道，SLC26A4 基因在我國最常見突變位點(diǎn)是c.919-2A＞G、c.2168A＞G、c.1174A＞T、IVSl5+5G＞A、c.1229C＞T 及c.1975G＞C，并且具有種族特異性[3]。其中c.919-2A＞G 單等位基因突變頻率為7.6%，該突變占SLC26A4 外顯子7 和8 中所有突變等位基因的99%，但復(fù)合雜合性在兩個(gè)突變等位基因的患者中占近60%，由此可見針對SLC26A4 基因所有位點(diǎn)進(jìn)行篩查是很有必要的[8-10]。c.919-2A＞G 為剪切位點(diǎn)變異，屬于功能缺失型變異。該變異可導(dǎo)致Pendrin 蛋白發(fā)生功能障礙，使得內(nèi)耳內(nèi)的淋巴液流動(dòng)發(fā)生異常，從而引起內(nèi)淋巴管內(nèi)壓升高和前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大，最終內(nèi)耳毛細(xì)胞受損和聽神經(jīng)萎縮出現(xiàn)聽力下降[5]。c.1174A＞T 變異較c.919-2A＞G 罕見，屬于錯(cuò)義突變，導(dǎo)致氨基酸N392Y 改變，肖彩霞等[11]報(bào)道了1 例，李琦等[12]報(bào)道了3 例，Liu 等[13]報(bào)道過2例，但都沒有闡述具體的致病機(jī)制。C.230A＞T 和c.1547dupC 更是罕見，其中c.230A＞T 屬于錯(cuò)義變異，而c.1547dupC 屬于框移變異。C.230A＞T 突變導(dǎo)致K771 氨基酸的改變，從而影響整個(gè)pendrin 蛋白的功能[14]。C.1547dupC 突變導(dǎo)致了S517fs 氨基酸的改變，Liu 等[13]也報(bào)道過2 例。C.230A＞T、c.1174A＞T 和c.919-2A＞G 雖然都是罕見的突變，但是這三種突變極少出現(xiàn)純合突變，基本上都是以和SLC26A4 基因其他突變位點(diǎn)復(fù)合雜合的形式出現(xiàn)，都會(huì)導(dǎo)致不同程度的耳聾。

本研究中男性患者屬于SLC26A4 基因三個(gè)致病雜合突變的復(fù)合雜合子，而女性患者在相同的基因兩個(gè)致病雜合突變的復(fù)合雜合子，其中一個(gè)突變與男性相同。該男性的父母及姐姐都是聾啞人，很可能是從其父母SLC26A4 基因不同突變位點(diǎn)遺傳得來，導(dǎo)致三個(gè)位點(diǎn)的復(fù)合雜合子，這是比較罕見的，遺憾的是他的父母及姐姐拒絕基因檢測。而女方是比較常見的LVAS 復(fù)合雜合子患者，其基因的來源也因?yàn)槭穷I(lǐng)養(yǎng)兒而不能追尋。但根據(jù)單基因遺傳病的孟德爾遺傳定律，該對夫婦生育LVAS 患兒的風(fēng)險(xiǎn)為100%，可不生育、領(lǐng)養(yǎng)、供精或供卵形式獲取健康后代。由此可見，我們通過對聾人夫婦的耳聾基因進(jìn)行檢測，并進(jìn)行遺傳咨詢，可以避免遺傳風(fēng)險(xiǎn)明確的夫婦生育耳聾后代，有效降低耳聾的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。