李楠，李亞娟，郭海濱，張向前

插入突變體的遺傳學綜合性實驗設計與探討

李楠1，李亞娟1，郭海濱1，張向前2

1. 華南農業(yè)大學公共基礎課實驗教學中心，廣州 510642 2. 華南農業(yè)大學林學與風景園林學院，廣州 510642

學生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)已成為中國高等教育的重要導向，加強綜合設計性實驗的應用是提高大學生創(chuàng)新能力的有效途徑。文章以水稻插入突變體為實驗材料，以突變體表型觀測作為實驗切入點，以遺傳分析和轉座檢測為實驗學習重點，重新設計了一個分子遺傳學綜合性實驗項目。在此基礎上，通過知識拓展環(huán)節(jié)引導學生利用開放實驗平臺學習TAIL-PCR技術，進一步進入研究性實驗。通過綜合性實驗到研究性實驗的遞進式教學體系，能夠使學生深入理解表型與基因的內在聯(lián)系、跳躍基因的概念以及轉座子在基因功能研究中的重要作用，加深學生對基因概念及遺傳規(guī)律的認識和理解，提升學生理論知識與實驗技能的整合運用能力。

綜合性實驗；實驗教學；基因突變

遺傳學是探究生物遺傳和變異規(guī)律的理論科學，是生命科學領域的基礎學科，研究內容豐富，小到基因結構、功能及表達，大到生物群落的遺傳特征[1]。遺傳學理論與實踐關系密切，實驗不僅是遺傳學的重要基礎，更是培養(yǎng)創(chuàng)新能力的重要環(huán)節(jié)[2]。為提升遺傳學實驗教學質量和促進創(chuàng)新人才培養(yǎng)，華南農業(yè)大學于2007年構建了“一般性實驗—綜合性實驗—研究性實驗”的遞進式遺傳學實驗教學新體系，提出適合華南農業(yè)大學農科類專業(yè)的“創(chuàng)新型混合教學模式”[3]。2012年，華南農業(yè)大學實現(xiàn)了遺傳學實驗教學的獨立設課，新編《遺傳學綜合性實驗》教材和實驗教學大綱，將遺傳學實驗從16學時的一般性實驗調整至32學時的普通遺傳學實驗和48或64學時的遺傳學綜合設計性實驗。

當前華南農業(yè)大學本科遺傳學實驗教學主要分為3大類綜合性實驗項目：細胞遺傳學綜合性實驗、經典遺傳學綜合性實驗及分子遺傳學綜合性實驗。分子遺傳學綜合性實驗從2012年應用至今已有7年，以秈粳水稻葉片為材料，利用特定SSR引物擴增秈粳水稻的DNA片段，實現(xiàn)對不同材料的區(qū)分。該實驗主要以植物DNA提取、PCR擴增和凝膠電泳檢測等分子標記相關技術的學習為主，已遠不能滿足創(chuàng)新型人才培養(yǎng)需要。

為提升遺傳學綜合設計性實驗項目的質量，適應當代教學的需要，利用水稻插入突變體材料，以培養(yǎng)學生科研思維和研究方法作為實驗教學目標，以遺傳分析法和PCR檢測技術為學習重點，重新設計了分子遺傳學綜合性實驗。使學生通過本實驗項目的學習，能夠理解表型與基因的內在聯(lián)系，了解跳躍基因的概念以及轉座子的重要應用價值，掌握科學研究的思維方式與研究方法，提升對理論與實踐、知識與技術的整合運用能力。

1 實驗材料的背景

粒重是決定水稻產量的3個主要因素(即每株有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和粒重)之一，是粒長、粒寬和粒厚的綜合指標。而水稻粒長、粒寬及長寬比又稱為水稻谷粒形狀，是衡量稻米外觀品質的重要指標之一，同時還影響稻米的商品品質和加工品質(糙米率、精米率和整精米率)。近年來，水稻粒形相關基因的研究取得了突破性進展。目前，至少已有93個水稻粒形相關基因被克隆，遍布水稻12條染色體[4~7]。本實驗所用的突變體材料是一個轉座引起的粒型突變體，其谷殼大小與野生型無異，而穎果顯著縮小，該突變體表型為不完全顯性遺傳；利用轉座子標簽法，采用TAIL-PCR[8](thermal asymmetric interlaced PCR)技術已獲知候選基因位于水稻第11號染色體，該基因屬于類伸展蛋白基因家族，是一個控制水稻重要農藝性狀的新基因。

該材料是由/雙因子轉座系統(tǒng)轉化至粳型品種中花11號獲得[9]，其中用于轉化的質粒為pDsBar1300，用于轉化的質粒為pUbiTs (圖1)[9]。pDsBar1300質粒的T-DNA區(qū)中攜帶轉座子，的內部插入基因，能提供對Basta (商用除草劑，有效成分為膦絲菌素PPT)的抗性，在的旁側插入潮霉素磷酸轉移酶基因(hygromycin phostrans-ferase,)，能提供對潮霉素的抗性。將篩選得到的水稻轉化純合體和轉化純合體進行雜交，構建了多個雜交組合，通過轉座酶的反式活化使發(fā)生轉座[9]。

2 實驗設計

2.1 設計思路

利用該材料進行綜合性實驗設計，先將以上科學研究的實驗材料與野生型雜交獲得F1，并自交獲得F2分離群體，以該突變體、野生型、F1雜合體、F2群體的成熟谷粒及對應水稻葉片作為課程實驗材料。首先讓學生通過觀察與考種實驗發(fā)現(xiàn)突變體、野生型和F1雜合體在谷殼和米粒上的異同；其次提供F2群體米粒，通過米粒寬度測量及方差分析，引導學生對該材料進行表型觀察和遺傳分析；再次提供學生F2群體水稻葉片，利用PCR檢測技術，分析突變體表型與插入之間的關系，驗證表型調查結果。最后通過知識拓展環(huán)節(jié)，結合理論教學讓學生深入了解轉座因子在基因功能研究中的應用價值。并以突變體為例，探討如何實現(xiàn)該類型材料(例如T-DNA或轉座子插入突變體)的基因克隆及功能分析。該實驗整個教學設計基于問題引導式教學模式(problem-based learning)，以問題為導向，引導學生在實驗中發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、提出問題、研究問題并解決問題，最后得出科學研究結論，進而培養(yǎng)學生科學研究的思維方式，提升學生對理論與實踐、知識與技術的整合運用能力和創(chuàng)新實踐能力。

圖1 質粒T-DNA區(qū)和TAIL-PCR引物所在位置示意圖

A：質粒pDsBar1300中T-DNA區(qū)及PCR檢測引物位置示意圖。：潮霉素抗性基因；35S-Pro：35S啟動子；：基因能提供對Basta的抗性；tra4、P5和P10：轉座檢測的3條引物。B：質粒pUbiTs中T-DNA區(qū)示意圖。Ubi-Pro：Ubi啟動子；Nos-Pro：Nos啟動子；：基因編碼新霉素磷酸轉移酶，能賦予細胞抗卡那霉素的能力。LB和RB：T-DNA的左右邊界。C：TAIL-PCR引物所在位置示意圖。

2.2 實驗涉及的主要理論知識與實驗技術

該實驗涉及的理論知識點與實驗技術主要包括孟德爾遺傳定律、轉座子及TAIL-PCR技術。分離定律是孟德爾遺傳定律之一。在雜合子細胞中，位于一對同源染色體上的等位基因，在進行減數(shù)分裂時等位基因會隨著同源染色體的分開而分離，分別進入兩個配子中，獨立地隨配子遺傳給后代，在F2代性狀發(fā)生3∶1或1∶2∶1的分離[10]。

轉座子(transposon)是染色體上可復制和位移的一段DNA序列。轉座子可以通過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個位置“跳躍”到另一個位置。在各種功能基因組學研究方法中，利用轉座子插入誘變的方法被認為是進行大規(guī)模基因功能鑒定的有力工具[11]，目前已有多例用/轉座系統(tǒng)成功分離水稻基因的報道[12,13]。

TAIL-PCR技術，即交錯式熱不對稱PCR，通過利用已知的DNA序列設計一組特異性引物，并結合隨機簡并引物，采用高溫特異性擴增與低溫隨機擴增相結合的方法，獲得轉座子插入側翼區(qū)特異擴增片段，相應擴增片段可直接測序分析，篩選分離基因。

2.3 實驗材料與方法

2.3.1 實驗材料

將突變體與野生型雜交，并將F1自交獲得的F2群體，以突變體、野生型、F1雜合體及F2群體的成熟谷粒，F(xiàn)2群體谷粒對應的水稻葉片作為課程實驗材料。所有材料均種植于華南農業(yè)大學農場，單株種植，常規(guī)管理。

2.3.2 實驗方法

2.3.2.1 突變體的鑒定和遺傳分析

一個實驗班人均約30人，將學生以5人為一組，提供給每組同學野生型、突變純合體、突變雜合體谷粒各1袋，每袋100粒。F2群體210株對應收獲種子210袋，每袋100粒?？挤N方法為10粒為1組，3次重復，整齊擺放，配置游標卡尺與分析天平測量。利用ImageJ軟件獲取考種數(shù)據(jù)，并運用SPSS18.0軟件進行卡方檢驗和t檢驗。

2.3.2.2轉座的PCR檢測

轉座的PCR檢測參照劉芳等[9]方法。因子切離的PCR檢測利用引物P10、Tra4和P5同時擴增。如果未發(fā)生切離，稱為滿載供體位點(full donor site, FDS)，通過引物P10和P5可以擴增出約400 bp的特異帶；如果從T-DNA上切離，稱為空載供體位點(empty donor site, EDS)引物Tra4和P5可以擴增出約870 bp的特異帶；如果既存在EDS又存在FDS，則利用3條引物可以同時擴增出兩條特異帶。

具體實驗步驟包括基因組DNA提取、PCR擴增、電泳分離、數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析等。每年在田間種植兩親本各20株、F120株和F2群體210株。待上課前1周取F2群體每株上部葉片置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

水稻DNA提?。喝?~4 cm長的葉片用液氮研磨至粉末，加入TPS抽提液(100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，10 mmol/L EDTA，1 mol/L KCl)1000 μL，75℃水浴30 min；13 000r/min離心12 min，吸上清約500 μL轉入1.5 ml離心管中，加入等體積遇冷的異丙醇，?20℃放置10 min，13 000 r/min離心5 min，棄上清，干燥沉淀，加200 μL滅菌水溶解，4℃冰箱冷藏備用。

PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測：學生使用自己提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，每個模板使用3條引物(P10、Tra4和P5)同時擴增。擴增后的PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結果，記錄樣品基因型。

2.3.2.3 突變體基因克隆

利用水稻的/雙因子轉座系統(tǒng)，篩選轉座插入純合體植株為材料，采用TAIL-PCR[8]的方法擴增元件旁側的水稻基因組序列，分析插入位點旁鄰序列，通過序列比對確定該基因在水稻染色體上的具體位置，并對候選基因進行了分析。TAIL-PCR反應所用引物見表1，其位置示意圖如圖1所示，特異擴增得到的第3輪PCR產物用來測序。在水稻基因組中的插入位置運用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析工具完成。因子插入所在位點相關基因預測信息可以在水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫獲得(http://rice.plantbiology.msu. edu/)。

表1 實驗所用引物

DsR-primer：元件3′末端特異的嵌套引物；AD primer：熔解溫度較低的隨機簡并引物；W：“A/T”堿基；N：“A/C/G/T”堿基；S：“C/G”堿基。

2.4 實驗結果與討論

2.4.1 突變體鑒定與遺傳分析

水稻是1個轉座子插入引起的穎果明顯變小，而谷粒大小沒有改變的突變體(圖2A)。進一步分析表明，突變純合體穎果(20.25±0.26 mm，10粒)比野生型穎果寬(27.10± 0.43 mm，10粒)減少了25.3%，而其百粒重較野生型減少了33.6%；雜合體穎果比野生型寬度減少了18.5%，百粒重減少了25.2%。

為了研究突變體表型遺傳特性，我們構建了F2分離群體。在F2群體中，不同植株的穎果表型明顯不同，其中60株穎果寬度類似野生型，103株穎果寬度達22.09± 0.21 mm (10粒)，47株穎果寬度則與突變純合體無異?？ǚ綔y驗表明其分離比符合1∶2∶1 (2= 1.68<20.05,2= 5.99)，說明突變表型由1對不完全顯性基因調控。

2.4.2 突變性狀與共分離分析

為了分析突變體表型與之間的關系，并驗證表型調查結果，對F2分離群體做了轉座的PCR檢測(圖2B)。在F2代的210個單株的分離群體中，60株野生型植株均為未轉座類型，47株突變體植株為轉座純合類型，其余為轉座雜合類型，三者之間的比率同樣符合1∶1∶2。根據(jù)上述結果可以認為，該突變體的產生是由于轉座的插入所引起的，遺傳行為符合1對不完全顯性基因的分離模式，表明該突變表型與插入共分離，與F2群體穎果表型調查結果相吻合。

3 實踐教學中的課堂組織方式

3.1 以科研思路為導向，創(chuàng)新實驗內容、教學方法與組織方式

本實驗作為分子遺傳學綜合性實驗項目以培養(yǎng)學生創(chuàng)新思維與方法作為教學目標，將研究中發(fā)現(xiàn)的水稻插入粒型突變體作為實驗材料，以遺傳分析和PCR檢測技術為實操學習重點，并通過以下4步來完成實驗教學：(1)引導學生發(fā)現(xiàn)問題；(2)通過表型調查和方差分析分析問題；(3)將表型觀測與PCR檢測技術相結合，對突變體進行鑒定與遺傳分析提出問題；(4)通過知識拓展環(huán)節(jié)，結合轉座因子內容，以該材料為例深入講解轉座子的特征及應用價值，加深學生對跳躍基因概念的理解，進一步研究問題。

本實驗可分4次課完成，每周1次課，每次課4個學時，分為以下3大部分：

圖2 水稻pex1突變體表型及其分子檢測

A：水稻突變體谷粒和穎果表型。WT：野生型；：突變雜合體；：突變純合體。B：轉座的PCR檢測。M：100 bp DNA Ladder；1~7：檢測植株，其中植株4、7的未發(fā)生轉座，僅存在FDS，1和6為轉座純合體，僅存在EDS；2, 3, 5為轉座雜合體，既存在EDS又存在FDS。C：插入突變體TAIL-PCR產物瓊脂糖電泳分析。M：100 bp DNA Ladder; Ⅱ, Ⅲ：分別為TAIL-PCR第二、三輪產物。

(1)遺傳分析實驗部分1次課。1~2學時：首先提供給學生野生型突變體谷粒材料，引導學生對谷殼和米粒進行仔細觀察并發(fā)現(xiàn)問題。教師再講解考種的方法，指導學生用統(tǒng)計方法研究突變體表型特征。3~4學時：提供給每組F2群體谷粒，要求學生測量谷粒表型，利用卡方檢驗對突變體進行遺傳分析。在該節(jié)課中，所有學生均表現(xiàn)出對實驗的濃厚興趣，并能按時完成實驗。

(2)轉座的PCR檢測部分2次課，第一次課的實驗內容為提取水稻葉片DNA；第二次課的實驗內容為PCR擴增及電泳，拍照記錄帶型，要求學生課后對實驗結果進行統(tǒng)計分析。該部分實驗內容相對復雜，會有個別學生需要通過重復實驗才能完成。

(3)實驗結果討論與教學延伸部分1次課。首先組織學生匯報實驗結果，了解學生對科學研究的思路、方法及結果分析的掌握情況。其次，教師結合理論知識講解轉座子對其他基因表達調控及其在基因組進化和基因功能研究方面的重要應用價值。并以突變體為例，與學生探討D插入突變體的基因克隆技術和功能分析方法，拓展學生遺傳知識的深度與寬度。通過對實驗結果的討論不僅有助于提升學生實驗總結能力，更能激發(fā)學生進一步探索的興趣，課后一般會有超過半數(shù)的同學主動聯(lián)系老師進行研究性實驗或創(chuàng)新訓練項目拓展。

3.2 引導學生進行研究性實驗

針對部分對該突變材料和基因克隆感興趣的同學，引導他們利用開放實驗平臺，自行開展材料的基因克隆研究。教學方法為：

首先老師與學生通過課堂討論和文獻資料查閱了解插入突變體材料的基因克隆方法，與基因的圖位克隆方法相比較，并設計實驗方案。圖位克隆又稱定位克隆，用該方法分離基因的實質是尋找與目的基因緊密連鎖的分子標記，無需預先知道基因的DNA順序，但因需要構建遺傳分離群體而耗時較長。就插入突變體而言，由于插入序列是已知的，可以作為插入位點的分子標簽采用其他途徑克隆目的基因。在此基礎上，要求學生進一步查閱資料、閱讀文獻拿出插入突變體基因克隆可供選擇的多種方案(例如反向PCR和TAIL-PCR等)，通過比較分析，選用其中一種方法開展研究。在此過程中，教師需及時跟進、解疑答惑，并做好引導。教學實踐表明，幾乎所有學生均會優(yōu)先考慮選用TAIL-PCR方法進行該突變體的基因克隆。

確定采用TAIL-PCR方法后，師生共同討論、制定并修改完善實驗方案，根據(jù)實驗方案開展基因克隆研究，實驗過程中教師實時跟進指導。雖然TAIL-PCR擴增核酸的基本原理與普通PCR無異，但是需要研究者對基本的PCR擴增原理和影響因素有深刻的理解和把握。TAIL-PCR需3輪擴增，前一輪產物稀釋后用作后一輪擴增的模板，而且每輪的擴增尤其第一輪PCR擴增程序比普通PCR復雜；同時TAIL-PCR引物又有退火溫度較高的嵌套式特異性引物和退火溫度較低的兼并引物之別(圖1)。這些都是有別于普通PCR的地方，也是該研究型實驗教學的重點和難點。

TAIL-PCR 擴增3′旁鄰序列如圖2C所示，特異擴增的第三輪PCR產物可直接用于測序。獲得測序結果后，可指導學生利用公共核酸數(shù)據(jù)庫(National Center for Biotechnology Information)進行初步的生物信息學分析，例如BLAST比對等便可獲取目的基因的基本信息。本例的目的基因位于水稻第11染色體，屬于類伸展蛋白基因家族。至此，插入突變體基因分離最關鍵的一步已完成。但是在實際教學中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)學生需要重復多次才能獲得理想擴增，在此過程中老師耐心指導尤為重要。實驗最后，老師可結合TAIL-PCR電泳結果(如圖2C)提出如何判斷TAIL-PCR產物是否為特異擴增產物(由于特異引物是嵌套式的，第三輪產物比第二輪產物要小，可據(jù)此判別是否為特異擴增產物)，分析研究結果及問題，撰寫研究論文及研究報告。當然，后續(xù)有關基因功能的研究還有很多方面可以引導學生作進一步的思考。

4 教學中的思考與探索

該綜合性實驗融合了種子科學、經典遺傳學的孟德爾遺傳規(guī)律、基因組學的轉座因子和統(tǒng)計學方差分析等理論知識內容，結合了表型觀測、PCR檢測技術、TAIL-PCR技術、基因克隆技術和方差分析法等實驗內容。該綜合性實驗運用“綜合性實驗–研究性實驗”的遞進式教學體系，融合了“問題引導式—傳授式—分組合作式—討論分析式”混合教學法[14,15]，以培養(yǎng)學生創(chuàng)新思維和方法為教學目標，讓學生學會如何在科學研究中發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、提出問題、研究問題，最后得出科學研究結論；讓學生明白知識之間的聯(lián)系性和整體性，進而實現(xiàn)知識融會貫通；有助于學生在團隊協(xié)作中提升解決問題和創(chuàng)新實踐的能力，這也是科研成果轉化為本科實驗教學的一個有益探索。

但在教學實踐中，要使本課程達到最佳教學效果，還需要思考以下兩點：首先，本實驗所使用的材料來源于科學研究，與其相關的理論背景知識涉及不完全顯性遺傳與基因突變中的轉座因子，然而這部分理論知識在遺傳學理論教學中不是重點講解內容，容易被學生忽視。因此在實驗教學的過程中，需要將這部分理論知識整合進去，不僅讓學生通過實驗可以理解，更希望能引導學生將顯性與不完全顯性遺傳、跳躍基因與轉座子、轉座因子的分類及其與基因突變進行對比分析，并將它們融會貫通；其次，綜合性實驗和研究性實驗在教學中是層層遞進式關系，在培養(yǎng)學生綜合創(chuàng)新能力上發(fā)揮著不可替代的作用。綜合性實驗是學生進入科學研究領域前的傳送帶，旨在激發(fā)學生的研究興趣，并使其掌握基本的研究方法和實驗技能。研究性實驗是學生進入科學研究領域的縮影，旨在讓學生經歷科學研究的過程，了解科學研究方法，進而培養(yǎng)學生創(chuàng)新思維及解決問題的能力。在綜合性實驗設計與教學過程中，如何加強綜合性實驗與研究性實驗的關聯(lián)性與整體性，激發(fā)學生研究的興趣，引導學生進入研究性實驗，一直是我們教學過程中需要不斷思考與創(chuàng)新的地方。

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Design and exploration of genetic comprehensive experiments based oninsertion mutants

Nan Li1, Yajuan Li1, Haibin Guo1, Xiangqian Zhang2

The cultivation of innovative abilities has become an important guide for higher education in China. Strengthening the integrated knowledge to design experiments is an effective way to improve undergraduate students’ innovative abilities. Herein we designed a comprehensive experiment for molecular genetics by utilizing a riceinsertion mutant identified previously in our research project. In the comprehensive experiment, we adopt the method of scientific research as the main line of teaching and take the interesting phenotype of the rice mutant as the breakthrough point to reform and innovate genetics laboratory teaching. On the basis of this, we combined the progressive teaching method and guided the students to learn the TAIL-PCR skill and conduct an innovative experiment through expanding their knowledge. The comprehensive experiment will deepen students’ understandings of the relationship between genotypes and phenotypes, help them master the effective way of thinking and technologies for scientific research to further improve their ability of the integrated application capability of theory and practices.

comprehensive experiment; experimental teaching; gene mutation

2019-09-26;

2019-11-01

國家自然科學基金面上項目(編號：30900884，31671594)和華南農業(yè)大學2017年教學改革與研究項目(編號：JG17093)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 30900884, 31671594) and Teaching Reform and Research Projects of SCAU in 2017 (No. JG17093)]

李楠，碩士，實驗師，研究方向：遺傳學實驗教學與管理。E-mail: 523155900@qq.com

張向前，博士，副教授，研究方向：植物分子育種。E-mail: aacrav@163.com

10.16288/j.yczz.19-149

2019/11/7 14:34:00

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20191107.1151.002.html

(責任編委: 陳德富)