黃子瑩，李龍，李倩倩，劉向東,2，李長春,2

lncRNA TCONS_00815878對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化的影響

黃子瑩1，李龍1，李倩倩1，劉向東1,2，李長春1,2

1. 華中農業(yè)大學，農業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070 2. 廣西揚翔股份有限公司生產中心，貴港 537131

豬骨骼肌發(fā)育是一個復雜的生物學過程，其中骨骼肌衛(wèi)星細胞分化是影響骨骼肌發(fā)育的重要環(huán)節(jié)。近年來發(fā)現長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)在骨骼肌衛(wèi)星細胞分化中具有重要作用。為探究lncRNA TCONS_00815878對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化的影響，本研究利用qRT-PCR技術檢測出生7 d內大白仔豬6種組織(心臟、脾臟、肺臟、腎臟、背肌和腿肌)及從胚胎期到出生后5個不同時間點(35 d、45 d、55 d胚胎及產后第7 d和第200 d后腿肌肉組織) TCONS_00815878的表達情況；利用反義核苷酸(antisense oligonuc-leotides, ASO)在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞中敲低TCONS_00815878，檢驗分化標記基因和表達情況；通過生物信息學分析預測TCONS_00815878靶基因，并利用DAVID軟件在線預測其靶基因的功能與通路。結果表明：TCONS_00815878在豬心肌和腿肌中高表達；仔豬出生后7 d內，TCONS_00815878在豬肌肉組織中表達量不斷升高，第7 d達到高峰；在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖和分化過程中，TCONS_00815878在分化期表達量不斷上升，且在分化30 h表達量達到峰值；敲低TCONS_00815878后，和基因表達量降低，其中表達量顯著下降(0.05)。此外，功能預測結果發(fā)現，其靶基因富集到糖酵解和丙酮酸代謝等與骨骼肌衛(wèi)星細胞分化相關的多個生物學過程。本研究推測，lncRNA TCONS_00815878可能對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化起促進作用。

lncRNA TCONS_00815878；豬骨骼肌衛(wèi)星細胞；分化；敲低；靶基因

豬()骨骼肌生長發(fā)育與其產肉量高低直接相關。此外，因與人具有相似的解剖學和生理學特征，研究豬骨骼肌的發(fā)育規(guī)律對人類相關研究也大有裨益[1]。骨骼肌發(fā)育是一個復雜且有序的過程，是各種遺傳因素及調控因子共同作用的結果。骨骼肌衛(wèi)星細胞是位于肌肉組織基膜和肌細胞膜之間的骨骼肌干細胞，在骨骼肌發(fā)育與再生過程中發(fā)揮著重要作用[2,3]。骨骼肌衛(wèi)星細胞被激活后首先形成單核成肌細胞，增殖分化，隨后融合成多核肌細胞，進一步相互連接形成肌纖維，最終并排形成肌肉組織[4,5]。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度大于200 nt的非編碼RNA。研究證實，lncRNA在骨骼肌發(fā)育、肌細胞增殖與分化過程中發(fā)揮關鍵調控作用[6~8]。有關lncRNA參與骨骼肌發(fā)育的研究已有很多，但多集中對小鼠()的研究[9,10]。近年來，隨著生物信息學及生物檢測技術的發(fā)展，已在豬上獲得大量與肌肉發(fā)育潛在相關的lncRNA，但多數lncRNA作用還尚不明確[11]。TCONS_ 00815878是Tang等[12]對貴州小型豬9個組織和3個骨骼肌樣本進行高通量測序鑒定得到的肌肉組織特異性lncRNA，位于15號染色體，全長1089 nt，包含2個外顯子。為進一步探究TCONS_00815878在豬骨骼肌發(fā)育過程中的作用，本研究檢測了出生7 d內大白仔豬6種組織及從胚胎期到出生后5個不同時間點TCONS_00815878的表達情況，進一步在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞中對TCONS_00815878進行敲低處理，檢測其對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化產生的影響。最后通過生物信息學分析，預測TCONS_ 00815878的靶基因及其靶基因可能參與的生物學過程和通路。通過以上研究，推測TCONS_00815878可能對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化過程產生的影響，旨在為豬骨骼肌生長發(fā)育相關lncRNA的功能研究提供更有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分離和培養(yǎng)

出生7 d內大白仔豬(購自華中農業(yè)大學種豬場)，取兩后腿全部肌肉，置于裝有20~30 mL PBS (美國GIBCO公司)的培養(yǎng)皿中，在PBS中漂洗3次去除肌肉表面筋膜，剪碎組織肉樣至肉糜狀；將肉糜移至T75培養(yǎng)瓶，吸凈上清，向肌肉組織中加入2倍體積0.2% Ⅰ型膠原酶(美國GIBCO公司)工作液；37℃、1200r/min水浴震蕩消化2.5 h后加等體積終止培養(yǎng)基終止消化；過100目篩、200目篩及400目篩，2000 r/min離心10 min，除上清，加培養(yǎng)基重懸細胞，溶液移至10 cm培養(yǎng)皿；37℃、5% CO2貼壁培養(yǎng)2.5 h，將培養(yǎng)皿溶液上清移至新培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；衛(wèi)星細胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)培養(yǎng)24 h，用PBS清洗2遍并更換培養(yǎng)基。

1.2 樣品采集

取3頭出生7 d內大白仔豬(購自華中農業(yè)大學種豬場)，采集心臟、脾臟、肺臟、腎臟、背肌和后腿肌肉6種組織，用于檢測TCONS_00815878在不同組織中的表達量。

采集大白豬35 d、45 d、55 d胚胎及產后第7 d和第200 d的后腿肌肉組織，用于檢測TCONS_ 00815878從豬胚胎期到出生后不同時間點的表達量。上述所有組織樣品采集后，經液氮速凍，保存于?80℃?zhèn)溆谩?/p>

收集增殖期12 h、24 h和分化期12 h、24 h的豬骨骼肌衛(wèi)星細胞，檢測增殖期和分化期和的表達量，以確定豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖分化效果。

收集增殖期6 h、12 h、18 h、30 h、36 h和42 h及分化期0 h、6 h、12 h、24 h、30 h、36 h和42 h的豬骨骼肌衛(wèi)星細胞，檢測TCONS_00815878在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖與分化不同時期的表達量。

收集誘導分化24 h的豬骨骼肌衛(wèi)星細胞，分離其細胞質與細胞核RNA，用于檢測TCONS_00815878在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的細胞質和細胞核的表達量。

1.3 總RNA提取

組織總RNA提?。喝〃C80℃冰箱保存的組織樣品，從凍存管中取出適量迅速放入液氮預冷的研缽中，加入適當液氮后研磨，待研磨成粉后轉移到1.5 mL無RNA酶的離心管中，按照RNA提取試劑盒(德國Epigentek公司)說明書提取上述組織樣本中的總RNA，取1 μL樣品于NanoDrop 2000 (美國Thermo Scientific公司)分光光度計檢測濃度，260/280值在1.8~2.0之間則表示RNA純度較高。

細胞總RNA提?。簩⒘装鍍鹊呢i骨骼肌衛(wèi)星細胞棄掉培養(yǎng)基后，用PBS沖洗兩次，每孔直接加入1 mL Trizol，用移液槍吹打數次，室溫裂解5 min，然后吸入1.5 mL無RNA酶離心管，于?80℃冰箱儲存，后續(xù)RNA提取步驟與組織樣品RNA提取方法一致。

細胞核與細胞質RNA分離與提?。贺i骨骼肌衛(wèi)星細胞用預冷的PBS沖洗兩次，2187 r/min棄上清液。將沉淀重懸于0.2 mL裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、140 mmol/L NaCl、1.5 mmol/L MgCl2、0.5% IGEPAL、1 mmol/L DTT、1 U/μL RNase抑制劑)。將混合物冰上放置5 min，之后4℃、2187 r/min細胞懸液離心3 min。收集上清液到1.5 mL離心管(細胞質部分)，14 000 r/min離心4 min。剩余沉淀用0.2 mL裂解液沖洗2次(細胞核部分)。最后用1 mL Trizol提取所有細胞核和細胞質中RNA。

1.4 引物及反義核苷酸(antisense oligonucleo-tides, ASO)片段的設計、合成

lncRNA TCONS_00815878序列參考文獻[9]；和18S rRNA的mRNA序列由NCBI數據庫獲得。本研究采用Primer Premier 5軟件設計引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息詳見表1。

通過網站(http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.)在線設計敲低TCONS_00815878的ASO片段，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行全鏈硫代修飾。ASO序列為GGATCTGGATTATGAACTTG。

1.5 cDNA合成和qRT-PCR擴增

參照SMARTerTMPCR cDNA Synthesis Kit試劑盒(日本TaKaRa公司)操作說明書反轉錄合成所有組織和豬骨骼肌衛(wèi)星細胞中的cDNA，反轉錄產物于?20℃保存?zhèn)溆茫?8S rRNA為內參，qRT-PCR檢測TCONS_00815878表達量。反應總體系為10 μL：SYBR Green 5 μL，ddH2O 3.6 μL，引物各0.2 μL，cDNA 1 μL。反應條件：95℃ 2 min；95℃ 15 s， 56℃/60℃ 20 s，72℃ 15 s，40個循環(huán)；95℃ 5 s，58℃ 5 s，95℃ 50 s，1個循環(huán)。擴增結束后進行溶解曲線分析。

1.6 TCONS_00815878靶基因及功能預測

根據參考文獻[9]測序結果中的蛋白編碼基因表達量數據，計算TCONS_00815878與蛋白編碼基因之間的Pearson相關系數，預測TCONS_00815878靶基因。選擇0.05、Pearon相關系數0.95的基因作為靶基因[13](附表1)。利用DAVID功能注釋生物信息學芯片分析預測靶基因功能與通路，取結果0.05為有效功能預測結果。

表1 本文所用引物信息

1.7 lncRNA TCONS_00815878敲低實驗及靶基因驗證

1.7.1 豬骨骼肌衛(wèi)星細胞轉染及TCONS_ 00815878敲低實驗

在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)豬骨骼肌衛(wèi)星細胞，接種至六孔板，ASO敲低組(ASO)和對照組(NC)均設3個重復，待細胞密度達到80%左右進行轉染實驗，每孔ASO轉染量為200 pmol。待細胞密度達到90%~ 100%更換分化培養(yǎng)基，分別于誘導分化后18 h、30 h收取細胞，進行RNA提取。qRT-PCR檢測TCONS_00815878及和在不同分化時期表達量。

1.7.2 免疫熒光分析

將細胞用預冷的PBS洗滌2次，用預冷的4%多聚甲醛(廣州賽國生物科技有限公司)室溫靜置固定15 min。PBS洗滌后，用預冷的0.25% TritonX-100 (廣州賽國生物科技有限公司)室溫靜置處理10 min。PBS洗滌，封閉液4℃封閉1~2 h (封閉液：3%BSA, 0.3%T TritonX-100, 10%FBS，PBS)。PBS洗滌細胞，4℃孵育一抗過夜(抗體稀釋液：3%BSA，0.3% TritonX-100, PBS)。之后37℃孵育二抗1 h。最后使用DAPI對細胞進行染色，熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.7.3 靶基因功能驗證

使用敲低TCONS_00815878后的細胞樣品。以18S rRNA為內參，qRT-PCR檢測靶基因和的表達量。反應總體系為10 μL：SYBR Green 5 μL，ddH2O 3.6 μL，引物各0.2 μL，cDNA 1 μL。反應條件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 15 s，40個循環(huán)；95℃ 5 s，58℃ 5 s，95℃ 50 s，1個循環(huán)。擴增結束后進行溶解曲線分析。

1.8 統計分析

qRT-PCR擴增結果參照2–ΔΔCt方法[14]評估TCONS_00815878及和相對表達量，以18S rRNA作為內參基因，0.05表示為差異顯著，0.01表示為差異極顯著。每項檢測設置3個生物學重復，每個生物學重復設置3個技術重復，由GraphPad Prism 6.0軟件完成統計并作圖。生物信息學分析結果由Excel軟件統計，利用R軟件分析作圖。

2 結果與分析

2.1 TCONS_00815878表達特征及核質定位

利用qRT-PCR檢測出生7 d內大白仔豬心臟、脾臟、肺臟、腎臟、背肌和后腿肌肉6種組織中TCONS_00815878的表達量(圖1A)。結果表明，TCONS_00815878在心臟、背肌和后腿肌肉中表達量較高，在其他組織中不表達。取35 d、45 d、55 d胚胎及產后第7 d和第200 d大白仔豬后腿肌肉組織，檢測TCONS_00815878表達量(圖1B)。結果表明，TCONS_00815878表達量在胚胎期35 d和45 d呈緩慢下降趨勢，從45 d開始呈上升趨勢，直至仔豬出生后第7 d達到峰值。

圖1 TCONS_00815878表達特征及核質定位結果

A：lncRNA TCONS_00815878在豬不同組織中的表達量；B：TCONS_00815878從豬胚胎期到出生后不同時間點表達量；C：TCONS_00815878核質定位結果。

提取分化24 h豬骨骼肌衛(wèi)星細胞中細胞質和細胞核RNA，qRT-PCR檢測TCONS_00815878表達量(圖1C)。結果表明，TCONS_00815878在細胞核中高表達，推測其可能在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的細胞核中發(fā)揮作用。

2.2 TCONS_00815878對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化的影響

收集增殖期12 h、24 h和分化期12 h、24 h豬骨骼肌衛(wèi)星細胞，qRT-PCR檢驗骨骼肌細胞體外增殖及誘導分化效果。結果表明，增殖期標記基因和在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖期呈上升趨勢，至增值期24 h達到峰值，之后在分化期表達量不斷下降(圖2A；附圖1A)。分化期標記基因和表達量在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖期呈下降趨勢，分化初期表達量上升，末期表達量下降。分化期標記基因在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達量，從增殖期到分化期12 h呈上升趨勢，之后下降(圖2B；附圖1，B和C)。表明豬骨骼肌衛(wèi)星細胞體外誘導分化成功。

收集增殖期6 h、12 h、18 h、30 h、36 h和42 h及分化期6 h、12 h、24 h、30 h、36 h和42 h的豬骨骼肌衛(wèi)星細胞，提取總RNA，反轉錄得到cDNA，qRT-PCR檢測豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖期和分化期不同時間點TCONS_00815878的表達量。結果表明，在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖期，TCONS_00815878表達量普遍較低，分化初期呈上升趨勢，分化30 h達到峰值，說明TCONS_00815878可能作用于豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化過程(圖2C)。因此，本研究通過網站在線設計ASO片段，在分化期豬骨骼肌衛(wèi)星細胞中敲低TCONS_00815878。檢測結果表明，在分化期18 h和30 h的豬骨骼肌衛(wèi)星衛(wèi)星細胞中，ASO敲低組與對照組相比TCONS_00815878表達量顯著降低(<0.001)，表明ASO片段具有明顯敲低效果，可 用于后續(xù)TCONS_00815878表達調控分析(圖3，A和B)。

在分化18 h和30 h收集細胞，qRT-PCR檢測豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化標記基因和的表達量。結果表明，在分化18 h和30 h，基因表達量顯著下降(<0.05)，和基因呈下降趨勢，推測TCONS_00815878可能促進豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化(圖3，C和D)。通過免疫熒光檢測敲低后細胞樣品中基因表達量，發(fā)現基因表達量顯著下降(<0.01) (圖3E)。以上結果初步說明TCONS_00815878可能影響豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化過程。

2.3 TCONS_00815878靶基因功能預測及驗證

通過計算TCONS_00815878與其他蛋白編碼基因的表達量相關性，預測得到TCONS_00815878的多個靶基因(附表1)。利用DAVID軟件在線預測靶基因功能，推測TCONS_00815878可能通過調控其靶基因，參與生長因子合成、糖酵解和代謝等與骨骼肌發(fā)育有關的多個生物學過程(圖4A，附表2)。其中和等基因參與糖酵解 代謝(glycolytic process，glycolysis和glycolysis/ gluconeogenesis)過程，和等基因參與生長因子結合(growth factor binding和GTPase activator activity)等過程。最后，本研究選取與TCONS_00815878表達呈正相關性的和基因，利用qRT-PCR在敲低TCONS_00815878的細胞中檢測其表達量。結果表明，和基因表達量顯著下降(0.05)，驗證了靶基因預測結果的準確性(圖4B)。通過以上結果，提示TCONS_ 00815878可能通過調控其靶基因進而影響骨骼肌發(fā)育過程。

圖2 豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化效果及TCONS_00815878在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞不同時期表達量

A，B：增殖期基因與分化期基因的表達；C：TCONS_00815878在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖和分化不同時間點的表達量。

圖3 TCONS_00815878對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化影響

A，B：誘導分化18 h和30 h后TCONS_00815878表達量；C，D：敲低TCONS_00815878分化18 h和30 h后分化標記基因的表達情況；E：敲低TCONS_00815878后免疫熒光圖片(400í)及基因表達量。比例尺為20 μm。*表示<0.05，差異顯著；**表示<0.01，***表示<0.001，差異極顯著；NC：正常對照。

3 討論

運用高通量測序和生物信息學分析技術，目前已鑒定得到了大量的功能基因[15]。研究證實，人類基因組75%以上的基因被選擇性地轉錄，但只有少部分被翻譯，其余不具有任何編碼能力的轉錄物被標注為非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)[16]，其中長度大于200 nt的為lncRNA[17]。越來越多的研究表明，lncRNA參與多種細胞和組織的發(fā)育過程，如基因組印記、干細胞維持、胚胎發(fā)育及成肌過程等[18~22]。然而，目前l(fā)ncRNA的功能研究，在豬上仍處于探索的初級階段[23]。

圖4 TCONS_00815878靶基因功能預測及驗證結果

A：GO富集分析和KEGG通路分析結果圖；B：ASO敲低樣品中靶基因表達量檢測結果。*表示<0.05，差異顯著。

豬骨骼肌的發(fā)育主要取決于肌纖維的生成，胚胎期35~90 d的兩次生長波以及出生后1~60 d肌纖維類型的轉變，對骨骼肌最終的發(fā)育起關鍵作用[24,25]。本研究利用qRT-PCR檢測大白豬胚胎期35~55 d及出生后7 d和200 d不同時間點后腿肌肉組織中TCONS_ 00815878表達量，結果推測該lncRNA可能在豬胚胎期和出生早期發(fā)揮作用。

豬骨骼肌衛(wèi)星細胞是研究骨骼肌發(fā)育規(guī)律進行研究的理想材料[26]，本研究利用豬骨骼肌衛(wèi)星細胞進行TCONS_00815878核質定位實驗，結果表明TCONS_00815878主要分布在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的細胞核中。另外，在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖與分化期不同時間點檢測TCONS_00815878表達量，結果推測該基因主要在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化期發(fā)揮作用。在分化期豬骨骼肌衛(wèi)星細胞中敲低TCONS_ 00815878，qRT-PCR和免疫熒光實驗結果均表明，相較于對照組，敲低組中基因的表達量顯著下降。以上結果推測TCONS_00815878可能促進豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化。

LncRNA作用范圍廣泛，調控機制復雜。根據lncRNA不同的作用模式分為順式(cis)和反式(trans)兩種調控模式，其中反式調控模式可以通過計算lncRNA與蛋白編碼基因的表達量相關性預測lncRNA靶基因[27]?；赥ang等[12]分析得到的各基因表達量，本研究通過計算TCONS_00815878與其他蛋白編碼基因的表達量相關性，找到其可能參與調控的多個靶基因?；蚬δ芨患治霭l(fā)現其靶基因富集到多個與肌肉發(fā)育相關的通路，其中和基因參與糖酵解代謝過程，和基因參與生長因子結合過程。已有研究表明，糖酵解過程可以通過促進成肌細胞增殖與分化來支持胚胎肌肉生長[28]。Mangano等[29]研究表明，基因可以通過促進多不飽和脂肪酸的合成間接促進肌肉的生長發(fā)育。而和基因作為糖酵解或丙酮酸代謝的關鍵基因，在肌肉生長發(fā)育中起促進作用[30]。為驗證靶基因預測準確性，本研究利用qRT-PCR在敲低后細胞樣品中檢測與TCONS_00815878表達呈正相關性的和基因表達量，發(fā)現和基因表達量與對照組相比下降顯著(0.05)，由此推測TCONS_00815878可能通過調控其靶基因間接參與骨骼肌的發(fā)育。本研究初步探討了lncRNA TCONS_ 00815878對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化可能起到的調控作用，為深入揭示lncRNA TCONS_00815878在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化和骨骼肌發(fā)育中的作用機制提供參考。

附錄：

附表1、附表2和附圖1見文章電子版www.chinagene.cn。

附表1 靶基因列表

Supplementary Table 1 List of target genes

附圖1 豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖期和分化期標記基因的表達

Supplementary Fig. 1 Expression level of marker genes in proliferative and differentiation phases of porcine skeletal muscle satellite cells

A：基因表達量；B：基因表達量；C：基因表達量。

[1] Groenen MAM, Archibald AL, Uenishi H, Tuggle CK, Takeuchi Y, Rothschild MF, Rogel-Gaillard C, Park C, Milan D, Megens HJ, Li ST, Larkin DM, Kim H, Frantz LAF, Caccamo M, Ahn H, Aken BL, Anselmo A, Anthon C, Auvil L, Badaoui B, Beattie CW, Bendixen C, Berman D, Blecha F, Blomberg J, Bolund L, Bosse M, Botti S, Bujie Z, Bystrom M, Capitanu B, Silva DC, Chardon P, Chen C, Cheng R, Choi SH, Chow W, Clark RC, Clee C, Crooijmans RPMA, Dawson HD, Dehais P, De Sapio F, Dibbits B, Drou N, Du ZQ, Eversole K, Fadista J, Fairley S, Faraut T, Faulkner GJ, Fowler KE, Fredholm M, Fritz E, Gilbert JGR, Giuffra E, Gorodkin J, Griffin DK, Harrow JL, Hayward A, Howe K, Hu ZL, Humphray SJ, Hunt T, Hornsh?j H, Jeon JT, Jern P, Jones M, Jurka J, Kanamori H, Kapetanovic R, Kim J, Kim JH, Kim KW, Kim TK, Larson G, Lee K, Lee KT, Leggett R, Lewin HA, Li YR, Liu WS, Loveland JE, Lu Y, Lunney JK, Ma J, Madsen O, Mann K, Matthews L, McLaren S, Morozumi T, Murtaugh MP, Narayan J, Nguyen DT, Ni PX, Oh SJ, Onteru S, Panitz F, Park EW, Park HS, Pascal G, Paudel Y, Perez-Enciso M, Ramirez-Gonzalez R, Reecy JM, Zas SR, Rohrer GA, Rund L, Sang YM, Schachtschneider K, Schraiber JG, Schwartz J, Scobie L, Scott C, Searle S, Servin B, Southey BR, Sperber G, Stadler P, Sweedler JV, Tafer H, Thomsen B, Wali R, Wang J, Wang J, White S, Xu X, Yerle M, Zhang GJ, Zhang JG, Zhang J, Zhao SH, Rogers J, Churcher C, Schook LB. Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography and evolution., 2012, 491(7424): 393–398.

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The effect of lncRNA TCONS_00815878 on differentiation of porcine skeletal muscle satellite cells

Ziying Huang1, Long Li1, Qianqian Li1, Xiangdong Liu1,2, Changchun Li1,2

Porcine skeletal muscle development is a complex biological process, and differentiation of skeletal muscle satellite cells is an important part of skeletal muscle development. In recent years, it has been found that lncRNA plays an important role in the differentiation of skeletal muscle satellite cells. Here we investigate the effect of lncRNA TCONS_00815878 on the differentiation of porcine skeletal muscle satellite cells. We first used qRT-PCR to detect the expression levels of TCONS_00815878 in six tissues (heart, spleen, lung, kidney, back muscles and leg muscles) of Yorkshire piglets within seven days of birth.At the same time, the expression levels of TCONS_00815878 at five different time points from the embryonic stage to the postnatal stage (35 d, 45 d, 55 d of embryos, and 7 d, 200 d of postpartum leg muscles) were examined. The expression of the differentiation marker genes,andwas examined by knocking down TCONS_00815878 in porcine skeletal muscle satellite cells using antisense oligonucleotides (ASO). The target gene of TCONS_00815878 was predicted by bioinformatics analysis, and the function and pathway of its target gene were predicted online using DAVID software. The results showed that TCONS_00815878 had the highest expression level in pig myocardium and leg muscles. Within seven days after birth, TCONS_00815878 increased in the muscle tissue of pigs, and reached the peak of expression level on the 7th day. During the process of proliferation and differentiation of porcine skeletal muscle satellite cells, the expression level of TCONS_00815878 increased during the differentiation stage and peaked at 30 h of differentiation. After knocking down TCONS_00815878, the expression levels ofandwere decreased, but the expression level ofwas significantly decreased (<0.05). In addition, functional predictions revealed that the target gene of TCONS_00815878 is enriched in multiple biological processes, such as glycolysis and pyruvate metabolism, related to skeletal muscle satellite cell differentiation. This study speculates that lncRNA TCONS_00815878 may promote the differentiation of porcine skeletal muscle satellite cells.

lncRNA TCONS_00815878; porcine skeletal muscle satellite cells; differentiation; knockdown; target gene

2019-05-21;

2019-11-19

國家自然科學基金項目(編號：31872322)和中央高校創(chuàng)新研究基金項目(編號：2662017PY030)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31872322) and Central University Innovation Research Fund (No. 2662017PY030)]

黃子瑩，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：動物遺傳育種大數據分析。E-mail: 327620138@qq.com

李長春，博士生導師，研究方向：豬重要經濟性狀的表觀遺傳學基礎。E-mail: lichangchun@mail.hzau.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-146

2019/12/7 17:08:48

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20191206.0936.004.html

(責任編委: 李明洲)