郭鵬 李漢周 劉松林 林剛 紀燕娟 朱國強

1.中石化江蘇油田分公司石油工程技術(shù)研究院 2.江蘇省油氣微生物技術(shù)工程研究中心 3.中石化江蘇油田分公司采油一廠

含油污泥是在石油開采、油氣集輸、煉制加工及含油污水處理過程中產(chǎn)生的一種由原油、水、重金屬和污泥組成的固體廢棄物。根據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)，“十一五”末我國每年產(chǎn)生含油污泥總量超過500×104t，按排污標(biāo)準(zhǔn)計算費用，直接處理成本高達50億元。含油污泥具有污泥數(shù)量大、費用高的特點[1]。污泥中除含有大量殘留油類外，還含有蒽、酚類等有毒物質(zhì)，寄生蟲、病原菌以及Cr、Cu、Pb等重金屬，多氯聯(lián)苯、二噁英、放射性元素等有毒有害物質(zhì)，若不加以處理，不僅污染環(huán)境，而且還造成資源浪費[2]。含油污泥黏度大、乳化程度高，油、泥、水三相分離困難，同時因含油污泥的來源不同，其性質(zhì)差別較大，因而具有處理難的特點[3-4]。

相對于物理和化學(xué)處理技術(shù)，含油污泥生物處理技術(shù)的優(yōu)點是操作方便，處理成本低，作用持久，無二次污染，已在國外得到商業(yè)化應(yīng)用[5]。特定微生物對含油污泥中的石油和有機物有很強的降解能力，最終可轉(zhuǎn)化成無害的CO2、H2O等[6]。同時，處理過程中能夠增加土壤腐殖質(zhì)含量，其處理方式包括堆肥處理法、土壤耕作法、微生物降解法等[7-8]。MISHRA等[6]采用原位生物修復(fù)技術(shù)研究了微生物對煉油廠含油污泥的處理能力，加入培養(yǎng)好的菌種與營養(yǎng)物質(zhì)120天后，油含量(原最高為99.2 g/kg)降低了90.2%；歐陽威等[9]采用微生物菌劑強化和堆制強化技術(shù)對油含量為 12.68%的污泥進行處理，56 天后，油含量降至6.42%。GC-MS 分析得出，微生物菌劑強化分解僅對碳原子數(shù)小于21的直鏈烷烴有著良好的降解效果，因而該技術(shù)存在難以選擇到合適的菌種，處理周期長，對環(huán)烷烴、芳烴類等非直鏈烷烴處理效果差，對油田含油污泥難適應(yīng)等問題[10-12]。

1 材料與方法

1.1 材料

離心管、塑料袋、取樣鏟、保溫盒；LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g(Bact-tryptone;Qbiogene 進口)、酵母膏5 g(yeast extract；Qbiogene 進口)、NaCl 10 g、瓊脂18 g、Tris-HCl (Premega 進口)、EDTA-Na2(Premega進口)、β-巰基乙醇 (FLUKA進口)、氯仿(FLUKA進口)、異戊醇(FLUKA進口)。

-80 ℃超低溫冰箱、制冰機、高壓蒸汽滅菌鍋(Tony)、超凈操作臺、培養(yǎng)箱、高倍顯微鏡、生物顯微鏡、高速冷凍離心機、751型分光光度計、恒溫水浴、核酸電泳設(shè)備。

采集江蘇油田站點含油污泥及污水。樣品置于已滅菌、密閉的離心管中，密封保藏于低溫容器內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1菌株的富集、分離純化

稱取5 g含油污泥或5 mL污水水樣，加入裝有100 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r/min的恒溫搖床條件下培養(yǎng)，5天后吸取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)5天。如此連續(xù)富集培養(yǎng)25天.培養(yǎng)液經(jīng)稀釋后涂布在固體PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)。

待平板長出菌落后，挑取不同形態(tài)的單菌落，采用劃線分離法反復(fù)進行分離純化，直到得到單菌株的純培養(yǎng)物，純化后的菌株保存于培養(yǎng)基斜面。

1.2.2菌株的篩選

(1)初篩。將純化的菌株分別接種到裝有100 mL降解用液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r/min下培養(yǎng)5天，將培養(yǎng)液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，觀察各菌株在固體培養(yǎng)基中的生長情況，篩選出生長較快、菌落較多的菌株并鏡檢觀察菌株形態(tài)。

(2)復(fù)篩。挑取各菌株的單菌落分別接種到裝有50 mL液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)24 h，測定菌液在600 nm處的吸光度，用滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其質(zhì)量濃度，使光密度(optical density,OD)600 nm約為0.4，以此稀釋的菌液作種子接種篩選培養(yǎng)基。

(3)評價。吸取5 mL準(zhǔn)備好的種子液接種到裝有100 mL篩選培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)4天后測定石油含量。每次單菌落評價做3次重復(fù)試驗，根據(jù)3次試驗的平均除油率，篩選得到除油率較高的菌株。

(4)分子生物學(xué)鑒定。設(shè)計16S rDNA 通用引物(Primer A：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Primer B：5’-GCTACCTTGTTACGACTT-3’)，以分離篩選菌株DNA為模板，采用菌落PCR方法進行16S rDNA 序列擴增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：ddH2O 34 μL、10×buffer 5 μL、5 μL Mg2+、dNTP 2.5 μL、rTaq 0.5 μL、Primer A與Primer B各1 μL、模板DNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循環(huán)33次；72 ℃總延伸5 min。PCR產(chǎn)物連接克隆載體pEASY-T3并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top-10中，由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。測序的16S rDNA序列與已登錄Genbank數(shù)據(jù)庫的基因片段進行blast比對，并利用MEGA 5.0軟件比較同源性和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 降解試驗與討論

2.1 污泥組成

由于油田含油污泥本身的非均相特點，在不同站點及同一站點不同位置的污泥，其形狀差異較大?，F(xiàn)場采集站點2中3#樣品，測試污泥組成，油泥兩項組分中油質(zhì)量分數(shù)為20.4%。污泥組成及干污泥中重金屬含量見表1。

表1 站點2中3#樣品原始污泥組成Table 1 Composition of raw sludge in sample 3#組分質(zhì)量分數(shù)/%組分質(zhì)量分數(shù)/(mg·kg-1)油2.3硼122.1水89.0鎳33.6油水不溶物9.0汞0.4鉛32.6砷11.4鉻45.7

2.2 菌株篩選

使用上述初篩方法，觀察各菌株在固體培養(yǎng)基中的生長情況，篩選出生長較快、菌落較多的菌株并鏡檢觀察菌株形態(tài)。根據(jù)菌株特性及生長繁殖速度，初步篩選得到12株菌，顯微形態(tài)見圖1。

使用上述復(fù)篩方法，篩選出除油率較高的4株菌株，代號分別為Yn-33、Yn-1、Yn-5、Yn-3。

將復(fù)篩得到的菌株接種到含原油(質(zhì)量濃度為85 mg/L)的無機鹽培養(yǎng)基中，200 r/min搖床培養(yǎng)7天，利用紫外分光光度計測定殘余油吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出殘余油的質(zhì)量濃度，計算篩選菌株對原油的除油率，實驗結(jié)果見圖2。

結(jié)果表明，Yn-1和Yn-3培養(yǎng)7天后的除油率分別為22.7%和20.9%，相對于其他具有較好活性的菌株，具有更強的原油降解效率，說明分離篩選的石油烴降解菌株Yn-1和Yn-3對石油烴具有較高活性和適應(yīng)性，能有效降解培養(yǎng)基中原油物質(zhì)。進一步改善菌株的降解環(huán)境條件，提高菌劑降解效率為技術(shù)工藝的重點。

采用分子生物學(xué)鑒定方法，判定菌株Yn-1和Yn-3分別為短芽孢桿菌(Bacillus brevis)和賴氨酸芽孢桿菌(Bacillus lysine)。

2.3 菌種制備

將篩選出的石油烴降解菌株接種在篩選配方固體培養(yǎng)基的方形瓶中，25 ℃靜置培養(yǎng)3～4天，形成細菌芽胞以制備菌種。無菌條件制備孢子懸浮液，經(jīng)70～75 ℃水浴10～15 min，獲得發(fā)芽勢強、發(fā)育一致的孢子懸浮液，作為發(fā)酵菌種用于接種培養(yǎng)及小試試驗。

2.4 生物活化劑的篩選

油田含油污泥中水含量、油含量較高(見圖3)。油田含油污泥一般黏度大、乳化程度高，油、泥、水三相分離困難，使得油田含油污泥的生物降解過程難度較大。改善生物降解環(huán)境是提高生物降解效率的重要途徑，在原始污泥中投加生物活化劑是重要手段之一。以站點2中3#樣品為對象，試驗中考察污泥在不投加菌劑而單純投加不同生物活化劑條件下的對油泥團粒結(jié)構(gòu)影響及其對相同菌株生物降解最終效果的影響，優(yōu)選生物活化劑。

將定量油泥與定量的麥麩等4種生物活化劑(代號分別為E-M、E-D、E-T、E-G)混合后，置于25 ℃干燥箱中使水分自然蒸發(fā)，待水分蒸發(fā)至小于10%時，取出樣品，采樣，使用篩分法進行分級試驗，分析處理油泥土樣團粒結(jié)構(gòu)組成。

由圖4可見，油泥中添加不同活化劑成分后，油泥團粒結(jié)構(gòu)有較大變化。4種生物活化劑中以E-G對油泥團粒結(jié)構(gòu)影響最大，處理油泥團粒中大粒級(>5 mm、3～5 mm、1～3 mm)達21.1%，其次為E-D和E-M。采集站點2中3#含油污泥樣品，分別配制包含上述4種生物活化劑和相同菌劑的污泥生物反應(yīng)系統(tǒng)，混合后置于小試裝置中，在菌劑與生物活化劑共同作用下，進行20天生物降解試驗，過程中污泥外觀性狀變化，如圖5所示。

測試對比經(jīng)不同生物活化劑體系處理的污泥除油效果，結(jié)果見圖6。從污泥除油率的變化上看，生物活化劑的投加顯著增強了油泥中石油烴的降解效果。其中，采用E-G生物活化劑體系菌劑的除油效果最好，培養(yǎng)箱處理20天后，除油率達85.21%；E-T、E-D體系處理的，除油率分別為83.72%、82.21%，對照樣品CK，其除油率僅13.58%。

2.5 試驗裝置與流程

為評價開發(fā)的菌株對于污泥中石油烴降解效果及其影響因素，評價生物活化劑體系對其他不同站點污泥的除油效果，設(shè)計開發(fā)了小試裝置。該裝置由生物反應(yīng)、供氣、記錄等幾個單元組成，每批次可獨立進行3個箱體生物降解試驗，試驗中每個箱體中可填充10 kg污泥(見圖7)。

試驗中，分別采集不同站點的原生含油污泥，在定量污泥中依次投加不同的污泥生物活化劑、Yn-1和Yn-3菌劑等物料，均質(zhì)后，置于圖7所示的試驗裝置中，開展含油污泥生物降解試驗，周期性記錄降解過程中溫度等參數(shù)的變化，試驗結(jié)束后取樣測試污泥中殘余油含量，評價除油效果。

2.6 降解試驗與降解效果

按照上述實驗結(jié)果，選擇E-G生物活化劑體系，采集現(xiàn)場不同站點的含油污泥，將生物降解菌、活化劑等按比例和油泥混拌均勻后，置于小試試驗裝置中，按照第2.3節(jié)所述實驗方法與流程，進行生物降解試驗。

試驗過程中保持污泥溫度為20～35 ℃，培養(yǎng)20天后，取樣測定處理油泥內(nèi)部微生物數(shù)量，并檢測油泥除油率，數(shù)據(jù)如表2所列。

表2 生物活化劑及菌劑對不同站點污泥的降解效果Table 2 Degradation effect of biological activator and microbial agent on sludge at different sites污泥樣品來源w(原始污泥油)/%,干基w(處理后污泥油)/%,干基除油率/%平均除油率/%站點140.738.7178.61站點220.493.0385.21站點329.835.1682.70站點451.5210.6679.3081.46

表2數(shù)據(jù)表明：采用生物活化劑及菌劑處理，經(jīng)過20天生物降解，各站點污泥平均除油率81.46%；對于油含量相對較低的污泥(油含量20.49%)，除油率為85.21%。

3 修復(fù)試驗與討論

3.1 植物與微生物體系對降解油泥的修復(fù)

油泥經(jīng)微生物降解后仍具有一定的生物毒性，利用特性植物可以修復(fù)和消除由有機毒物和無機廢物造成的土壤環(huán)境污染。植物在生長過程中可直接或間接地吸收、分離或降解有機污染物，從而起到消除有機污染的作用。同時，植物生長與土壤微生物存在密切的關(guān)系，植物生長過程中根際的微生物也可和植物協(xié)同降解或固化有機污染物，植物與微生物的協(xié)同作用能明顯提高修復(fù)效果。

試驗過程中，選擇站點2中3#原始油質(zhì)量分數(shù)20%(干重)經(jīng)過降解處理后油質(zhì)量分數(shù)為2%～5%的污泥土壤作為修復(fù)試驗對象。

修復(fù)過程不僅有利于促進植物克服油泥土壤毒性完成適生性生殖，同時還能優(yōu)化土壤微生物類群，有助于促進石油烴降解菌的活性發(fā)揮，增強植物-微生物的綜合降解效能。

3.1.1植物-微生物修復(fù)體系中適生植物的生長情況

通過豆科、禾本科等9種不同類型植物品種，開展適生性篩選試驗。

結(jié)果表明(見表3)，油泥土對多種篩選植物具有普遍生物毒性，但不同植物適應(yīng)程度不同。豆科植物的黃豆、黑豆、綠豆適生性較弱，其中綠豆在油泥土中具有一定的適生性，但其在降解油泥中不能生根，綠豆在油泥土中雖能生長發(fā)芽，但生長受到顯著抑制；禾本科的BB、AA、CC等植物的適生性較強，在降解油泥及優(yōu)化的油泥土中都能生根、發(fā)芽及生長，其中以BB、AA適生性較強。

雙子葉植物篩選發(fā)現(xiàn)，十字花科的植物對油泥生物毒性最為敏感，在油泥土、降解油泥中均不能生根、發(fā)芽和生長，可以作為生物毒性的指示植物。

而植物CC卻具有較強的耐受能力，在降解油泥和優(yōu)化的油泥土中均能生根、發(fā)芽和生長。因此，選擇AA、BB、CC 3種植物作為降解油泥的種植修復(fù)植物。

表3 不同植物在降解油泥及優(yōu)化油泥土中的適生性篩選Table 3 Suitability screening of different plants in degrading oil sludge and optimizing oil sludge植物降解油泥油泥土生根發(fā)芽生長適生性生根發(fā)芽生長適生性DD++--+++++黃豆-----++-黑豆-----++-綠豆-+---+++苜蓿++--+++-AA++++++++++++++茼蒿-----+--CC+++++++++++BB++++++++++++++ 注: +表示適生程度,-表示抑制程度。

3.1.2不同修復(fù)體系和修復(fù)周期對石油烴降解效果分析

以標(biāo)準(zhǔn)原油為試樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到原油含量與吸光度的回歸方程：y=0.0434x+0.0005(R2=0.9946)，如圖8所示。

測定3種修復(fù)體系中第1次種植(30天)的油泥土原油含量從3.81%下降解到1.65%～2.33%，其中以AA體系降解效率最高。第2次種植后原油含量進一步降低，降解效率最高為AA-促生菌體系，原油質(zhì)量分數(shù)降至1.41%，如表4所列。

表4 不同修復(fù)周期油泥中含油率測定Table 4 Determination of oil content in oil sludge in different repair periods含油率/%處理第1次種植第2次種植BB體系2.061.55AA體系1.651.41CC體系2.331.62平均值2.051.56

4 結(jié)論

(1)利用分子生物學(xué)技術(shù)手段，在油田污水污泥中篩選出2種石油烴降解菌Yn-1和Yn-3，分別為短芽孢桿菌和賴氨酸芽孢桿菌，除油率分別達到22.7%和20.9%。

(2)開發(fā)的生物活化劑改善了原始污泥的物理性狀，增強了菌劑降解活性，通過20天強制生物降解處理后的污泥，平均除油率達到81.46%。

(3)對于w(含油)<20%的油田含油污泥，采用生物降解后，再經(jīng)過兩個周期的植物與微生物修復(fù)，污泥w(含油)<2%，油含量達到SY/T 7301-2016《陸上石油天然氣開采含油污泥資源化綜合利用及污染控制技術(shù)要求》的指標(biāo)要求，滿足井場道路鋪設(shè)用土要求。