郭海陽，譚海生，陳麗偉，宋 貝，楊勁松*

（1.海南大學 食品科學與工程學院，海南 ?？?570228；2.海南大學 材料科學與工程學院，海南 ?？?570228）

γ-氨基丁酸（γ-aminiobutyric acid，GABA）是一種天然非蛋白質(zhì)組成成分的氨基酸，廣泛存在于動物、植物和微生物中[1]。GABA具有降低血壓、治療癲癇、改善腦細胞、增強記憶和促進睡眠等多種生理功能[2-4]，它不僅在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中充當重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，還參與多種生命代謝活動，對生物體正常的生命活動起著重要的調(diào)節(jié)作用，在非神經(jīng)的組織中發(fā)揮激素或營養(yǎng)因子的作用[5-6]。在微生物體內(nèi)，GABA的合成原理是以L-谷氨酸（L-glutamic，L-Glu）為底物，谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）為催化酶制劑將L-Glu或L-谷氨酸單鈉鹽（L-glutamic acid monosodium salt，L-MSG）脫羧獲得[7-8]。2009年，由生物法制備的GABA被批準為“新資源食品”，目前GABA作為一種新型的功能性因子，在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域都具有良好的應(yīng)用前景[9-10]。

為了更方便、快捷的檢測GABA含量，建立適應(yīng)復雜轉(zhuǎn)化液中定量分析GABA的方法是微生物法制備GABA的前提條件。由于GABA本身對紫外光吸收小，一般需要衍生化后才能使用紫外檢測器檢測[11]。目前常用的衍生試劑有苯二醛-2-巰基乙醇、丹磺酰氯以及鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）等[12-15]，其中OPA是最為常用的一般實驗選用的衍生試劑，具有衍生時間短、價格便宜、簡單易操作等優(yōu)點。目前GABA定量分析方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、電泳法和紙層析法等[16-19]，其中高效液相色譜法應(yīng)用最為廣泛。然而，由于GABA需要衍生化后才能檢測，加上出峰時間較長，目前面對大批量樣品時仍無法快速檢測。超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度均優(yōu)于HPLC。目前，UPLC多應(yīng)用于代謝組學分析及其他一些生化領(lǐng)域，在天然產(chǎn)物的分析方面運用也逐漸興起，因為在這些領(lǐng)域深入研究需要更高的分析精度。目前，利用UPLC法與HPLC法測定微生物制備液中GABA含量的研究鮮有報道，本試驗采用鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生-紫外檢測UPLC法與HPLC法進行方法學驗證和對比研究，旨在尋求一種快速準確測定乳酸菌發(fā)酵液中GABA含量的方法，以期為大通量篩選產(chǎn)GABA的乳酸菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

乳酸菌：本研究室保存的乳酸菌菌種。

1.1.2 化學試劑

γ-氨基丁酸標品（純度＞99.9%）：上海源葉生物科技有限公司；谷氨酸鈉（純度＞98.0%）：生工生物工程股份有限公司；甲醇（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；正丁醇、茚三酮、丁二酸鈉、硼酸、無水乙酸鈉（均為分析純）：廣州化學試劑廠；冰醋酸（分析純）：上海陸都化學試劑廠；β-巰基乙醇、鄰苯二甲醛：酷爾化學科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基中加2%瓊脂）：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母提取物0.5%、檸檬酸胺0.2%、葡萄糖2.0%、吐溫-80 0.1%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.058%、硫酸錳0.025%、調(diào)pH值為6.2～6.6。121 ℃條件下滅菌20 min，用于菌種的培養(yǎng)。

TYG液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.5%、酵母提取物0.5%、葡萄糖1.0%、丁二酸鈉0.5%，調(diào)pH值為6.5。121 ℃條件下滅菌20 min，用于發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

島津LC-2030高效液相色譜儀、UV-1800紫外可見分光光度計：日本島津儀器有限公司；ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜：美國Waters公司；Millipore純水儀：默克密理博（中國）有限公司；5417R離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

種子培養(yǎng)液制備：從MRS平板上挑取適量經(jīng)純化后的乳酸菌菌株，接種到種子培養(yǎng)基（MRS液體培養(yǎng)基中）中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)16 h。

發(fā)酵培養(yǎng)液制備：按體積分數(shù)3%的接種量取上述種子培養(yǎng)液接入到添加了1%谷氨酸的TYG液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，備用。

1.3.2 HPLC操作條件

參考李鵬等[20]的測量方法。衍生處理：取200 μL乳酸菌發(fā)酵液或GABA標準品溶液于5 mL的EP管中，加入600 μL的OPA衍生劑，混勻，然后再加入800 μL磷酸二氫鉀緩沖液，避光反應(yīng)1 min，經(jīng)0.22 μm過濾膜過濾后立刻進樣，整個衍生過程控制在3 min內(nèi)。

HPLC條件：Luna-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速0.8 mL/min；柱溫27 ℃；進樣量10 μL；檢測波長333 nm；流動相為醋酸-醋酸鈉緩沖液∶甲醇=55∶45，V/V。

1.3.3 UPLC操作條件

衍生處理同1.3.2。

UPLC條件：Acquity UPLC Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流速0.8 mL/min；柱溫27 ℃；進樣量10 μL；檢測波長333 nm；流動相為醋酸-醋酸鈉緩沖液∶甲醇=55∶45，V/V。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

分別吸取400 μg/mL和1 000 μg/mL的γ-氨基丁酸標準準溶液各200 μL，分別按1.3.3中的衍生處理對GABA標準溶液進行衍生，取衍生后的反應(yīng)液進行全波長掃描（200～800 nm），掃描結(jié)果見圖1。

圖1 γ-氨基丁酸標準品全波長掃描結(jié)果Fig.1 Full-wavelength scanning results of γ-aminobutyric acid standard

由圖1可知，220～278 nm干擾峰過多，峰值接近，無法明確區(qū)分，且不隨γ-氨基丁酸標準溶液濃度的變化而改變，主要是由于樣品中衍生劑的影響而導致的。γ-氨基丁酸標準溶液的最大吸收峰在波長310～370 nm處，且吸收峰區(qū)分明顯，周圍無干擾，最大吸收波長為333 nm。因此，進行UPLC和HPLC分析時以333 nm作為檢測波長。

2.2 GABA標準品的HPLC法和UPLC法測定

GABA標準品HPLC法和UPLC法分析結(jié)果見圖2。由圖2A可知，在1.3.3色譜條件下，標準液在高柱效Acquity UPLC Waters BEH C18色譜柱上得到了良好的洗脫和分離，GABA在柱上的保留時間是0.837 min。由圖2B可知，在1.3.2色譜條件下，標準液在Luna-C18色譜柱上得到了良好的洗脫和分離，GABA在柱上的保留時間是23.034 min。與HPLC法比，UPLC法的出峰時間明顯縮短，檢測效率有了顯著的提高，并且其他雜質(zhì)對測定沒有干擾，HPLC法和UPLC法都能很好的對GABA進行分離。

圖2 γ-氨基丁酸標準品分析UPLC（A）和HPLC（B）色譜圖Fig.2 Chromatogram of γ-aminobutyric standard by UPLC (A) and HPLC (B)

2.3 反應(yīng)時間對衍生反應(yīng)的影響

吸取200 μLγ-氨基丁酸標準準溶液，按1.3.2方法進行衍生，再分別放置0、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min后采用UPLC法檢測，考察不同放置時間對GABA峰面積的影響，并作色譜圖和峰面積的變化曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可知，γ-氨基丁酸標準溶液經(jīng)過柱前衍生反應(yīng)后，其響應(yīng)值（峰面積）會隨著放置時間的增加而明顯減小。6 min內(nèi)峰面積從8 900 216下降至4 561 646，可見γ-氨基丁酸衍生物極其不穩(wěn)定，其衍生產(chǎn)物會隨著衍生時間的延長而逐漸分解，因此衍生時間對試驗結(jié)果有顯著地影響，應(yīng)該嚴格控制衍生時間相同，以確保得到最大響應(yīng)值的同時降低誤差，保證試驗具有好的準確性和重現(xiàn)性，本試驗將整個衍生反應(yīng)過程控制在3 min。

2.4 γ-氨基丁酸標準曲線

將配制1000.0μg/mL的GABA標準品溶液稀釋成質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL、200.0 μg/mL、400.0 μg/mL、600.0 μg/mL、800.0 μg/mL的標準工作液，衍生后進樣。以峰面積（y）為縱坐標，標準液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。由表1可知，HPLC法和UPLC法在GABA質(zhì)量濃度為100.0～1 000.0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)R2均＞0.998）。

表1 γ-氨基丁酸標準曲線回歸方程Table 1 Regression equation of standard curve of γ-aminobutyric acid

2.5 精密度試驗

配制質(zhì)量濃度為800 μg/mL的γ-氨基丁酸標準溶液，采用UPLC和HPLC兩種方法對γ-氨基丁酸標準品和香蕉上初篩到的乳酸菌發(fā)酵液進行定量檢測，每個樣品在不同時間段各重復測量5次，并根據(jù)γ-氨基丁酸標準曲線計算樣品中的GABA含量，結(jié)果見表2。由表2可知，HPLC法的平均相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.175%，UPLC法RSD為0.529%，2種檢測方法的日內(nèi)精密度與日間精密度的RSD均＜1.5%，表明這2種方法均具有良好的精密度，并且UPLC法測量的結(jié)果更為精確。

表2 γ-氨基丁酸檢測精密度試驗結(jié)果Table 2 Results of precision tests of γ-aminobutyric acid determination

分別吸取不同編號乳酸菌發(fā)酵液各100 μL，再分別加入400.0 μg/mL的γ-氨基丁酸標準液100 μL。按1.3.3方法進行衍生，再采用UPLC法和HPLC法兩種方法測量GABA含量，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 γ-氨基丁酸檢測加標回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of standard recovery rate tests of γ-aminobutyric determination

由表3可知，UPLC法和HPLC法的平均回收率在98.28%～99.36%，超高效液相色譜法的RSD（0.680%）低于高效液相色譜的RSD（1.053%），說明UPLC法測量GABA時準確度更高。

2.6 乳酸菌發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量測定結(jié)果

取離心后的不同乳酸菌發(fā)酵液各200 μL，經(jīng)OPA柱前衍生后，采用UPLC法分別測定各發(fā)酵液樣品，每個發(fā)酵液測定5次，得到γ-氨基丁酸的峰面積。根據(jù)標準工作曲線的回歸方程計算，得到樣品中γ-氨基丁酸的含量，結(jié)果見表4。

表4 乳酸菌發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of γ-aminobutyric acid contents in lactic acid bacteria fermentation broth

由表4可知，通過UPLC法對5株產(chǎn)GABA的乳酸菌發(fā)酵液進行定量分析，最后篩出產(chǎn)γ-氨基丁酸最高的菌株編號為CT4-1，其γ-氨基丁酸的產(chǎn)量為928.095 μg/mL。

3 結(jié)論

本實驗對超高效液相色譜（UPLC）與高效液相色譜（HPLC）兩種方法進行對比研究，采用鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生-紫外測定乳酸菌發(fā)酵液中的γ-氨基丁酸（GABA）含量。試驗結(jié)果表明，GABA經(jīng)UPLC法與HPLC法2種方法測定的含量在所需質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.998）。UPLC法的平均相對標準差為0.529%，平均回收率為99.59%；HPLC法的平均相對標準差為1.175%，平均回收率為98.06%。精密度和回收率試驗表明，2種檢測方法均可準確定量分析乳酸菌發(fā)酵液中GABA含量。2種方法相比較，UPLC法的操作更為簡單、出峰時間短，色譜峰具有較好的分離度，測定結(jié)果準確，精密度好，靈敏度高，能夠滿足檢測大批量乳酸菌發(fā)酵液中的γ-氨基丁酸含量。