上官文菲，陳 合*，陳 婧，張 萌，郭余糧

（1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西雅泰乳業(yè)有限公司，陜西 咸陽(yáng) 713701）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）對(duì)人體有諸多生理功效，如降低血壓[1-2]、緩解緊張焦慮[3]、防止肥胖[4]、改善睡眠[5]、促進(jìn)身高增長(zhǎng)[6]等，還可促進(jìn)腎機(jī)能改善和保護(hù)作用。GABA廣泛存在于微生物、植物、動(dòng)物體內(nèi)[7]，在植物和微生物中，其在三羧酸循環(huán)中發(fā)揮著代謝功能[8]；在哺乳動(dòng)物中，其作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有誘導(dǎo)胰島素分泌[9]、調(diào)節(jié)腦內(nèi)蛋白合成[10]等多種重要的生理功能，在保健食品、飲品[11]、動(dòng)物飼料等方面展現(xiàn)了良好的前景。

GABA天然存在含量低，很難從一些天然動(dòng)植物組織中大量提取分離，目前制備GABA主要利用微生物發(fā)酵法[12-13]，這是一種既安全又低成本的方法[14]。乳酸菌是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌[15]。國(guó)內(nèi)外近年來(lái)也開(kāi)展了許多微生物發(fā)酵產(chǎn)GABA的研究。DIANA M等[16]研究發(fā)現(xiàn)，從西班牙奶酪中分離的乳酸菌株可在未經(jīng)優(yōu)化的全麥面粉溶液中大量轉(zhuǎn)化生成GABA，認(rèn)為在發(fā)酵食品中添加此類菌株可為開(kāi)發(fā)調(diào)節(jié)高血壓的功能性食品提供可能性；黃敏欣等[17]通過(guò)對(duì)黃酒的發(fā)酵工藝優(yōu)化后測(cè)得酒中的GABA含量達(dá)到309.09 mg/L，并證實(shí)其中有乳酸菌產(chǎn)生GABA；NORIKO K等[18]通過(guò)對(duì)發(fā)酵水產(chǎn)品中分離的副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）NFRI 7415發(fā)酵條件的探究，發(fā)現(xiàn)在底物濃度為500 mmol/L時(shí)，GABA產(chǎn)量為302 mmol/L；蘇曉琴[19]從傳統(tǒng)發(fā)酵米粉發(fā)酵液中篩選出產(chǎn)GABA的乳酸菌，利用該菌株研制出一種GABA含量可達(dá)25.02 mg/100 g的綠豆酸面團(tuán)面包，其具有獨(dú)特的風(fēng)味且消費(fèi)者的可接受度較高；韓昱姝等[20]從泡菜中篩選得到穩(wěn)定產(chǎn)生GABA的乳桿菌，以牛奶為底物發(fā)酵GABA產(chǎn)量可達(dá)到1.68 mg/mL；田蕊[21]通過(guò)產(chǎn)GABA乳酸菌的紫外誘變及發(fā)酵條件優(yōu)化，得到了GABA產(chǎn)量達(dá)到4.003 g/L的發(fā)酵菌株；SUNG H H等[22]利用從泡菜中分離出的短乳桿菌（Lactobacillus brevis）L-32進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生GABA，通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)證明了其可作為一種新型睡眠營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。

通過(guò)本課題組前期工作，分離篩選并鑒定得到菌株發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）SD2112，本研究以菌株SD2112為對(duì)象，以谷氨酸為底物，發(fā)酵生成GABA，并利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵條件，以提高GABA的產(chǎn)量，為后續(xù)應(yīng)用于乳品及其他食品提供研究基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA的研究，探索將乳酸菌產(chǎn)GABA應(yīng)用于功能性食品開(kāi)發(fā)的可能性，以期產(chǎn)生一定的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）SD2112：陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院生物工程系419研究室。

1.1.2 化學(xué)試劑

95%乙醇、次氯酸鈉（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；谷氨酸（分析純）：西安優(yōu)博生物技術(shù)有限公司；苯酚（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硼酸、硼砂（均為分析純）：天津市登峰化學(xué)試劑廠；γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）：西安優(yōu)博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基MRS肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV5300PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；pHs-3c酸度計(jì)、FA2204B電子天平：上海精科儀器有限公司；DH5000AB電熱恒溫培養(yǎng)箱、WG-71電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；TG16A-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將-18 ℃凍藏保存的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）SD2112菌株以5%的接種量接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，活化兩代后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株培養(yǎng)

將已活化兩代后保存于冰箱的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）SD2112按照5%的接種量，接種于含有50 mmol/L谷氨酸的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下，培養(yǎng)60 h，從而獲得含有GABA的發(fā)酵液。

1.3.3 分析檢測(cè)

（1）菌液pH值測(cè)定

在室溫條件下，使用pHs-3c酸度計(jì)直接測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

（2）γ-氨基丁酸含量測(cè)定

γ-氨基丁酸含量測(cè)定采用Berthelot比色法[23]。γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取質(zhì)量濃度為0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1 mol/L的NaCO3溶液0.1 mL，pH值10.0，0.2 mol/L的硼酸鹽緩沖液0.5 mL，6%苯酚1 mL，混勻后在室溫下，在5 min內(nèi)加入5.2%NaClO溶液1.0 mL，混勻，放置5～8 min。沸水浴10 min后立刻冰水浴20 min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液2.0 mL，混勻后在冰水浴中放置20～40 min。以空白試劑為參比，在波長(zhǎng)640 nm處測(cè)定吸光度值，并做3次平行樣。以γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（y=1.2356x+0.0644，R2=0.9913）計(jì)算發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量。

1.3.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

依次選取發(fā)酵溫度（28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）、初始pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、接種量（3%、4%、5%、6%、7%）、底物添加量（25mmol/L、50mmol/L、75mmol/L、100mmol/L、200mmol/L），考察其對(duì)GABA生成量的影響。

1.3.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以及通過(guò)對(duì)各試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以底物添加量、接種量、培養(yǎng)時(shí)間為考察因素，以GABA的產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，通過(guò)軟件Design-Expert8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及分析

以上試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。利用Origin8.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖及統(tǒng)計(jì)分析，Design Expert8.0.6進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始pH值對(duì)GABA產(chǎn)量的影響

在培養(yǎng)條件為接種量5%、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時(shí)間72 h、底物添加量50 mmol/L時(shí)，考察培養(yǎng)基的初始pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0時(shí)的GABA產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，菌株SD2112的GABA產(chǎn)量隨著pH值在4.0～6.0范圍內(nèi)的增大呈先升高后降低趨勢(shì)，說(shuō)明在較酸性環(huán)境中隨著pH值的上升，GABA的產(chǎn)量緩慢上升，在pH值達(dá)到5.0時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最大值1.639 g/L，隨后隨著初始pH值的升高，GABA產(chǎn)量明顯降低。由于pH值對(duì)微生物發(fā)酵是一重要因素[24]，該結(jié)果可能由于該pH值是GABA的代謝途徑中谷氨酸脫羧酶的適宜pH值，從而導(dǎo)致在pH值為5.0時(shí)GABA的產(chǎn)量最高，這與之前的研究結(jié)果相似[18，25]。因此最適初始pH值為5.0。

圖2 初始pH值對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of initial pH on γ-aminobutyric acid production

2.1.2 接種量對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

控制初始pH值5.0，考察接種量分別為3%、4%、5%、6%、7%時(shí)的GABA產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 接種量對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of inoculum on γ-aminobutyric acid production

由圖2可知，隨著接種量在3%～7%范圍內(nèi)的增加，菌株SD2112產(chǎn)GABA的量也隨之呈現(xiàn)一定趨勢(shì)，在接種量為4%～5%時(shí)，GABA的生成量急劇增加，而在接種量為6%和7%時(shí)，GABA生成量開(kāi)始緩慢降低。因此，最佳接種量為5%。

2.1.3 底物添加量對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

控制接種量為5%，考察底物添加量分別為25 mmol/L、50mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L時(shí)的GABA產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著底物添加量在25～200 mmol/L的增大，GABA的產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在添加量為50 mmol/L時(shí)，GABA產(chǎn)量最高為1.74 g/L，推測(cè)其原因可能為在GABA代謝途徑中添加量為50 mmol/L時(shí)谷氨酸脫羧酶活性最高，轉(zhuǎn)化谷氨酸生成GABA的量最大，在添加量為25 mmol/L時(shí)，底物含量過(guò)低，不足以支持GABA的大量轉(zhuǎn)化，而隨著添加量的升高，代謝過(guò)程受到了反饋抑制，導(dǎo)致谷氨酸脫羧酶活性降低[18]，從而GABA產(chǎn)量降低。因此，最佳底物添加量為50 mmol/L。

圖3 底物添加量對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of substrate addition on γ-aminobutyric acid production

2.1.4 培養(yǎng)溫度對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

控制底物添加量為50 mmol/L，考察培養(yǎng)溫度分別為28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃時(shí)的GABA產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on γ-aminobutyric acid production

溫度也是影響細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的重要因素之一，可影響細(xì)胞內(nèi)酶的產(chǎn)生以及生物合成等相關(guān)過(guò)程。由圖4可知，隨著培養(yǎng)溫度在28～37 ℃區(qū)間上升，GABA的產(chǎn)量也隨之上升，在37 ℃時(shí)達(dá)到最大值1.663 g/L，而培養(yǎng)溫度＞37 ℃之后，GABA產(chǎn)量顯著降低，這與其他研究結(jié)果基本相似，如馮志彬等[26]探究短乳桿菌的最佳工藝條件發(fā)現(xiàn)最適溫度為37 ℃。這可能是因?yàn)榇藴囟葹楣劝彼崦擊让复呋劝彼徂D(zhuǎn)化生成GABA的最適溫度，溫度過(guò)高則會(huì)破壞部分谷氨酸脫羧酶的活性，導(dǎo)致GABA的產(chǎn)量下降。因此，最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃。

2.1.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響

控制培養(yǎng)溫度為37 ℃，考察培養(yǎng)時(shí)間分別為48 h、60 h、72 h、84 h、96 h條件下，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on γ-aminobutyric acid production

由圖5可知，在培養(yǎng)時(shí)間為48～72 h時(shí)，GABA產(chǎn)量隨之增加，而在培養(yǎng)時(shí)間＞72 h后，GABA產(chǎn)量趨于平緩，可能是由于發(fā)酵后期的菌體進(jìn)入了穩(wěn)定生長(zhǎng)期，活菌數(shù)最多，代謝產(chǎn)物開(kāi)始積累，菌體可以將培養(yǎng)基中的底物緩慢轉(zhuǎn)化為GABA。因此，最佳培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

菌株SD2112的最優(yōu)單因素條件如下：底物添加量50 mmol/L、初始pH值5.0、接種量5%、37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以培養(yǎng)時(shí)間（A）、接種量（B）、底物添加量（C）這3個(gè)因素為自變量，以GABA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的試驗(yàn)，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)?zāi)Ｐ头治?，考察各因素之間的交互作用，并對(duì)最佳發(fā)酵工藝條件進(jìn)行預(yù)測(cè)。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合，得到各個(gè)因素對(duì)樣品GABA產(chǎn)量這一指標(biāo)的二次回歸方程如下：

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

由表3可知，回歸方程模型項(xiàng)P＜0.000 1，失擬項(xiàng)P=0.476 8＞0.05，由此可知建立二次的回歸模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著，表明建立的回歸方程擬合良好。影響因子A、B、C的P值均＜0.01，表明培養(yǎng)時(shí)間（A）、接種量（B）和底物添加量（C）對(duì)GABA的產(chǎn)量的影響較顯著。二次型A2、B2、C2的P值＜0.001，說(shuō)明這三個(gè)因素對(duì)GABA產(chǎn)量的影響不僅僅是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。二次回歸方程的決定系數(shù)R2為97.95%，說(shuō)明97.95%的響應(yīng)值變化可以用該模型解釋。校正決定系數(shù)R2adj=95.30%，與R2相近，進(jìn)一步說(shuō)明了模型的顯著性，因此可以用此回歸方程來(lái)預(yù)測(cè)發(fā)酵乳桿菌SD2112的GABA產(chǎn)量。

統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert.V8.0.6對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，得響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖6。

通過(guò)對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，得到最佳工藝條件為：底物添加量50 mmol/L、接種量5%、培養(yǎng)時(shí)間72 h。此條件下得出的GABA的產(chǎn)量理論值為2.578 g/L。通過(guò)使用所優(yōu)化的條件，進(jìn)行3組重復(fù)的驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)得到的GABA產(chǎn)量實(shí)際值為2.967 g/L，與預(yù)測(cè)值接近，證明利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的發(fā)酵工藝條件合理可靠。

圖7 培養(yǎng)時(shí)間、接種量及底物添加量對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation time,inoculum and substrate addition on γ-aminobutyric acid production

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化了發(fā)酵乳桿菌轉(zhuǎn)化谷氨酸生成GABA的發(fā)酵條件。結(jié)果表明，發(fā)酵乳桿菌SD2112產(chǎn)GABA的最佳發(fā)酵條件為底物谷氨酸添加量50 mmol/L、初始pH 5.0、接種量5%、37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，其GABA產(chǎn)量為2.967 g/L，是優(yōu)化前的2.6倍，達(dá)到了優(yōu)化的目的，并為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。