胡 楠，雷 鳴，王 碩，2*

（1.天津科技大學 食品工程與生物技術(shù)學院 食品營養(yǎng)與安全國家重點試驗室，天津 300457；2.南開大學 醫(yī)學院 天津市食品科學與健康重點試驗室，天津 300071）

酵母菌在世界各地的許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品和飲料的生產(chǎn)中均扮演著重要的角色[1]，并代表了該地區(qū)的飲食文化。酵母菌是一種單細胞真菌，屬于兼性厭氧菌，其對營養(yǎng)要求低，繁殖速度快，能夠利用食品原料中的碳水化合物發(fā)酵生成醇類化合物和二氧化碳等[2]。酵母菌在食品發(fā)酵過程中可以通過代謝產(chǎn)物和菌體自溶改良原材料的感官、營養(yǎng)和物理性質(zhì)等，賦予發(fā)酵食品獨特的風味[3]?，F(xiàn)今，酵母被廣泛應用于面包[4]、開菲爾[5]和酒精類飲料等[6-7]發(fā)酵食品。

傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料主要采用自然發(fā)酵的方式，利用水果果皮、環(huán)境或地域等天然存在的微生物作為發(fā)酵菌株[8]，通過微生物間的優(yōu)勝劣汰來完成發(fā)酵。其中主導發(fā)酵的真菌多為酵母菌[9]，但仍存在一些雜菌和少數(shù)致病菌，給食品安全帶來風險。自然發(fā)酵的方法存在發(fā)酵工藝不易控制和成品品質(zhì)參差不齊等缺點。利用生物學手段從自然發(fā)酵的藍莓飲料中分離篩選出發(fā)酵性能優(yōu)異的菌株，對于藍莓相關(guān)產(chǎn)品的研究開發(fā)、產(chǎn)品生產(chǎn)和質(zhì)量控制以及產(chǎn)品安全性方面都具有實際意義[10]，并可為后續(xù)研究發(fā)酵機理和功能成分代謝提供了理論基礎。

本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料中分離出酵母菌，通過形態(tài)學鑒定、ITS序列分析及生理生化試驗等，對酵母菌進行菌種鑒定及篩選，旨在對后期藍莓發(fā)酵產(chǎn)品的研制提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料A、B、C（鮮果加水補糖，密封自然發(fā)酵而得）：黑龍江省伊春市。

孟加拉紅培養(yǎng)基和酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；真菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：TIANGEN生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

DN-117M數(shù)碼生物顯微鏡：寧波永新光學股份有限公司；FE-28 pH計：瑞士梅特勒公司；HVA-110高壓滅菌器：日本HIRAYAMA公司；Gel Doc XR+凝膠成像儀、Sub-Cell GT電泳儀：美國Bio-Rad公司；5804 R離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA提取及16S rDNA測序

將傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）法[11]提取樣品DNA，以ITS 5-1737F和ITS 2-2043R為引物擴增真菌ITS 1區(qū)序列，并進行高通量測序文庫的構(gòu)建和Ion S5 XL平臺的單端測序。

1.3.2 酵母菌的分離純化及保種

試驗方法參考陳源源[12]的方法略有改動，具體如下：將傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料樣品等梯度稀釋后涂布于含有孟加拉紅培養(yǎng)基的無菌平板上，（28±1）℃厭氧培養(yǎng)5 d。挑取平板上無菌絲體的菌落進行三區(qū)劃線，重復3次，得到純化菌株。將純化后的菌株接入YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃過夜靜置培養(yǎng)。吸取10 μL該菌液再接入YPD液體培養(yǎng)基中重復培養(yǎng)3次后，進行保種及后期菌種鑒定。

1.3.3 酵母菌形態(tài)學分析與分子生物學鑒定

對菌株進行菌落特征觀察和細胞形態(tài)觀察[14]。

參照TIANGEN基因組DNA提取試劑盒[13]說明書進行DNA提取。以DNA為模板進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，引物分別為ITS 1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS 4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）[15]。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，將條帶清晰且單一[16]的PCR產(chǎn)物送至金維智生物科技有限公司進行測序。序列比對采用GenBank中的BLAST進行分析（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.3.4 酵母菌初篩

利用Geneious軟件將酵母菌純化菌株的DNA序列與樣品ITS高通量測序中所有操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）代表序列進行比對，選出與酵母菌的OTU代表序列匹配度為100%的菌株。

1.3.5 酵母菌復篩

（1）產(chǎn)氣試驗

試驗方法參考匡鈺等[17]的方法略有修改，具體如下：使用杜氏小管發(fā)酵法，進行酵母菌產(chǎn)氣試驗。將活化后的酵母菌液以7%（V/V）的接種量接入裝有10 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中，并放入杜氏小管，于30 ℃條件下靜置培養(yǎng)，每隔8 h觀察其杜氏小管中氣泡的大小。

（2）產(chǎn)乙醇試驗

樣品制備：將凍藏藍莓解凍，以1∶1（V/V）的比例加入純水，榨汁備用。取10 mL酵母菌液于離心管中，5 000 r/min離心5 min，棄上清液，用生理鹽水沖洗沉淀物，除去殘留的培養(yǎng)基。將菌體用生理鹽水懸浮，以3%的接種量接入藍莓果汁中，26 ℃條件下培養(yǎng)10 d[18]后，取2 mL發(fā)酵液適當稀釋，10 000 r/min離心5 min，取上清過濾（0.22 μm水系微孔濾膜）后，進行高效液相色譜分析，每個樣品重復3個平行。

乙醇標準溶液配制：準確吸取10 mL乙醇標品于100 mL容量瓶，加水定容至刻度線，充分混勻，得到10%乙醇標準溶液。取適量10%乙醇標準溶液進行梯度稀釋（5%、4%、3%、2%和1%）。

1.3.6 酵母菌發(fā)酵藍莓果汁的生長能力

取終點發(fā)酵液進行pH值的測定和酵母菌活細胞計數(shù)[20]。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016、SPSS Statistics 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料的物種相對豐度

分析傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料中的微生物組成可以更好地控制生產(chǎn)工藝以及成品質(zhì)量，通過ITS高通量測序得到傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料中真菌屬水平物種相對豐度，結(jié)果如圖1所示（僅展示相對豐度排名前十的物種）。由圖1可知，傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料真菌屬水平物種相對豐度中，只有德克酵母（Dekkera）、畢赤酵母（Pichia）和伊薩酵母（Issatchenkia）相對豐度＞1%。其中德克酵母（Dekkera）在各樣品中的相對豐度介于87.3%～92.2%之間，均值為89.3%，相對豐度排名第一，菌群優(yōu)勢明顯。據(jù)研究顯示，德克酵母（Dekkera）可以適應惡劣或受限（如較高的乙醇濃度、較低的pH值和較差的氮源）的環(huán)境條件[21]，適宜的生長溫度在19～35 ℃之間[22]，這些可能是其在傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料中菌群優(yōu)勢明顯的主要原因。此外，德克酵母（Dekkera）還對一些啤酒和葡萄酒的風味和香氣具有一定的貢獻[6]。畢赤酵母（Pichia）和伊薩酵母（Issatchenkia）在各樣品中的相對豐度分別為4.3%～7.9%和0.7%～2.5%，均值分別為6.3%和1.4%，顯然這兩種酵母菌并不是主要的發(fā)酵菌，可能在發(fā)酵過程中與發(fā)酵菌協(xié)同完成發(fā)酵，有報道顯示，畢赤酵母（Pichia）作為非釀酒酵母菌參與了葡萄酒的發(fā)酵[23]，伊薩酵母（Issatchenkia）在葡萄酒發(fā)酵中可以增加單萜含量，有助于葡萄酒的香氣[24]。

圖1 傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料屬水平物種相對豐度Fig.1 Relative abundance of species in traditional fermented blueberry beverages at genus level

2.2 形態(tài)學分析

通過分離純化得到部分純化菌株的菌落和細胞形態(tài)，如圖2所示。由圖2可知，a、b和c中菌落為圓形，邊緣整齊，菌落中心隆起，菌落為紅色，不透明，無菌絲，是典型的酵母菌菌落；d中菌體細胞呈卵圓形，大小不一，無菌絲；e中菌體細胞呈梭狀，無菌絲；f中菌體細胞呈棒狀，無菌絲；e和f中均可找到正在進行分裂的細胞。

圖2 酵母菌的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)Fig.2 Colony and cell morphology of yeasts

2.3 酵母菌分子生物學鑒定結(jié)果

以純化酵母菌菌株基因組DNA為模板，PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3所示。由圖3可知，ITS擴增產(chǎn)物介于750～1 000 bp之間，產(chǎn)物的電泳條帶單一且清晰，滿足測序要求。

經(jīng)過孟加拉紅平板劃線分離，共得到30株疑似酵母菌菌株。將30株菌株的測序結(jié)果與GenBank中已知序列進行同源性比對，確定測序菌株的屬水平信息，結(jié)果匯總于表1。由表1可知，30株疑似酵母菌菌株中，德克酵母（Dekkera）共10株，編號分別為YA 1～YA 4、YA 8～YA 10、YB 2、YB 3和YC 10；畢赤酵母（Pichia）共10株，編號分別為YB 6、YA 5和YC 2～YC 9；伊薩酵母（Issatchenkia）共5株，編號分別為YB 4、YB 5和YB 7～YB 9；假絲酵母（Candida）共5株，編號分別為YB 1、YB 10、YA 6、YA 7和YC 1。本次分離鑒定得到的菌種在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中均有過相關(guān)報道[21-24]，可繼續(xù)進行篩選試驗。

圖3 酵母菌PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of PCR products of yeasts

表1 純化酵母菌的ITS基因序列鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of purified yeasts by ITS gene sequences

2.4 酵母菌初篩

將上述30株酵母菌ITS序列與高通量測序得到的OTU代表序列進行BLAST比對。篩選與相對豐度Top 10操作分類單元的代表序列匹配度為100%的菌株進行后續(xù)試驗，篩選結(jié)果見表2。由表2可知，共篩選出5株酵母菌，其菌株編號分別為YA 1、YA 8、YB 6、YB 8和YC 5。這5株酵母菌作為后續(xù)酵母菌復篩試驗的試驗菌株。

表2 酵母菌初篩結(jié)果Table 2 Preliminary screening results of yeasts

2.5 酵母菌復篩

2.5.1 酵母菌產(chǎn)氣能力

通過酵母菌產(chǎn)氣能力試驗可以篩選出發(fā)酵性能良好，起酵速度快且生長旺盛的菌株，試驗結(jié)果匯總于表3。由表3可知，5株酵母的3次產(chǎn)氣試驗結(jié)果完全一致，均為陽性。其中菌株YA 1與YB 8在培養(yǎng)8 h左右，已有氣體產(chǎn)生；其他3株酵母菌均在培養(yǎng)16 h左右，開始產(chǎn)氣；在培養(yǎng)至24 h時，所有菌株產(chǎn)氣均充滿杜氏小管?？梢钥闯?株酵母菌都具有一定程度的產(chǎn)氣能力，其中菌株YA1與YB8的產(chǎn)氣能力相對較強。5株酵母菌的產(chǎn)氣能力均高于匡玉等[18，25]的報道。

表3 酵母菌的產(chǎn)氣能力Table 3 Gas production ability of yeasts

2.5.2 酵母菌產(chǎn)乙醇能力

將5株酵母菌分別投入藍莓果汁中進行發(fā)酵，通過高效液相色譜法檢測發(fā)酵后的乙醇含量，以確定酵母菌在藍莓果汁體系中的產(chǎn)乙醇能力，發(fā)酵液的高效液相色譜圖結(jié)果見圖4，酵母菌產(chǎn)乙醇能力的結(jié)果見圖5。

圖4 不同酵母發(fā)酵液的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of fermentation broth of different yeasts

圖5 酵母菌的產(chǎn)乙醇能力Fig.5 Ethanol production ability of yeasts

由圖5可知，5株酵母菌的發(fā)酵液中均有乙醇檢出。菌株YA 1、菌株YB 6和菌株YB 8所得到的乙醇含量最高，分別為9.73%、8.93%和9.55%；菌株YA 8和菌株YC 5次之，為6.77%和7.19%?？梢姡?株酵母菌作為藍莓果汁發(fā)酵菌株都有一定的產(chǎn)乙醇能力。由于藍莓果汁中含酸量較高，一般酵母菌不易生長[19]，對菌株進行針對性馴化后，可應用于藍莓果酒發(fā)酵。

2.6 酵母菌發(fā)酵藍莓果汁的生長狀態(tài)

由于藍莓果汁pH值較低，可能會抑制一些酵母菌生長。因此需要考察酵母菌在藍莓果汁中的生長能力，以反映其對低pH值的耐受情況。將5株酵母菌接入藍莓果汁中進行發(fā)酵，測定10 d時各菌株的活細胞數(shù)量和pH值，結(jié)果見表4。由表4可知，發(fā)酵10 d時，發(fā)酵液pH值均在2.6左右，活菌數(shù)＞108CFU/mL的菌株有YA 1和YB 8，其余3株菌株（YA 8、YB 6和YC 5）的活菌數(shù)均＜108CFU/mL。酵母菌在藍莓果汁中的活菌數(shù)量與孫煒寧等[26]報道相似，略高于吳啟鳳等[27]報道的pH 2.0條件下酵母菌存活情況。由以上結(jié)果可以看出，菌株YA 1和YB 8在藍莓果汁中的生長能力相對較強。

表4 酵母菌發(fā)酵藍莓果汁的活細胞計數(shù)和pH值Table 4 Viable yeast cell count and pH of fermented blueberry juice

3 結(jié)論

本研究通過高通量測序技術(shù)對傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)德克酵母（Dekkera）為主要真菌發(fā)酵菌屬。進一步利用微生物方法對傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料中的酵母菌進行分離，共得到30株酵母菌。利用分子生物學手段對純化菌株進行鑒定及初步篩選，有5株與傳統(tǒng)發(fā)酵藍莓飲料中相對豐度最高的酵母菌操作分類單元代表序列完全匹配。在產(chǎn)乙醇能力的測試中，YA 1、YB 6和YB 8三株酵母菌表現(xiàn)出較強的產(chǎn)乙醇能力。YA 1和YB 8兩株酵母菌在產(chǎn)氣能力測試和藍莓果汁發(fā)酵中均表現(xiàn)優(yōu)異。綜上所述，屬水平注釋信息為德克酵母（Dekkera）YA 1和伊薩酵母（Issatchenkia）YB 8的更適合應用于發(fā)酵藍莓果汁。