王麗媛，秦 文，霍軍生，卓 勤，楊 倬，王晶波，沈 葹，李 巖

（中國疾病預(yù)防控制中心 營養(yǎng)與健康所，北京 100050）

黃酒是世界上最古老的酒類之一，起源于中國，其釀造和飲用歷史已有5 000余年[1]。聞名于世的首推紹興酒。黃酒是以稻米、黍米、玉米、小米、小麥等為主要原料，采用蒸煮、加酒曲、糖化、發(fā)酵、壓榨等工藝而成的釀造酒[2]。黃酒含有多酚、類黑精、谷胱甘肽等生理活性成分，具有清除自由基，預(yù)防心血管病、抗衰老等生理功能[3]。黃酒在釀造過程中經(jīng)菌群酶的作用產(chǎn)生豐富的功能性低聚糖，可促進腸道有益菌群的定殖，從而改善腸道功能、增強機體免疫力[4]。

高脂飲食中食物脂肪含量高，長期食用會使體內(nèi)脂肪水平超出正常范圍，當(dāng)機體的能量攝入多于能量消耗時，肥胖就不可避免發(fā)生[5]。高脂肪飲食能夠引起腸道組織氧化應(yīng)急發(fā)生，改變腸道微生態(tài)[6]，而肥胖又易造成心血管等一系列疾病，危害人體健康[7]。

目前國內(nèi)對黃酒的功能作用研究比較深入，但對高脂肪飲食的動物研究相對較少。因此本研究通過對小鼠進行灌喂黃酒并飼喂高脂肪含量的飼料，研究黃酒對高脂飲食小鼠的肥胖指標(biāo)及腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性C57BL/6J小鼠（無特定病原（specific pathogen free，SPF）級，體質(zhì)量18～22 g）：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。

基礎(chǔ)飼料和高脂飼料：北京科澳協(xié)力飼料有限公司，飼料配方見表1。動物飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心南緯路動物實驗室，室溫20～26 ℃，相對濕度40%～70%，12 h光照，12 h黑暗。紹興黃酒（三年陳釀，原料：水、糯米、小麥，標(biāo)示酒精度15%vol）：市售。食用酒精（糧食酒精，普通級，酒精度95%vol）：市售。糞便基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：德國QIAGEN QIAamp DNA Stool Mini Kit公司。

表1 兩組飼料配方Table 1 Formula of two groups of feed

1.2 儀器與設(shè)備

7600全自動生化分析儀：日本HITACHI公司；Illumina HiSe2500測序儀：美國Illumina公司；NANO DROP紫外分光光度計：美國Thermo公司；ME403E天平：瑞士梅特勒公司；AC2-4S1生物安全柜：新加坡ESCO公司；5427R高速冷凍離心機：德國EPPENDORF公司；RV10V-C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

C57BL/6J小鼠共60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后按體質(zhì)量隨機分為5組，即空白對照組，飼喂基礎(chǔ)飼料；高脂對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，飼喂高脂飼料。每組12只，每6只一籠。以人體推薦量的5倍、10倍、30倍分別為低、中、高劑量組。按照《中國居民膳食指南》建議男性每日飲酒的酒精量≤25 g為參照，標(biāo)準(zhǔn)人體質(zhì)量60 kg計算，人體每日飲酒量為100 mL，低劑量組=8.3 mL/kg體質(zhì)量、中劑量組=16.6 mL/kg體質(zhì)量、高劑量組=50 mL/kg體質(zhì)量。將黃酒進行濃縮，用15%vol酒基按比例進行調(diào)配。高、中、低劑量組灌胃受試樣品，空白對照組和高脂對照組給予蒸餾水，灌胃體積0.2 mL/10 g體質(zhì)量，連續(xù)灌胃120 d。實驗期間各組小鼠自由飲食飲水，每周稱一次體質(zhì)量并調(diào)整灌胃量，每周記錄兩次動物的給食量、剩食量及撒食量。實驗結(jié)束時各組小鼠禁食12 h后稱質(zhì)量，摘眼球采血，離心收集血清待測；解剖取睪丸及腎周脂肪墊并稱質(zhì)量；無菌收集糞便-80 ℃冷凍保存待測。本研究動物實驗已通過中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所倫理審查。

1.3.2 血清生化指標(biāo)測定

小鼠血液經(jīng)3 000 r/min離心15 min分離血清，測定血清中血糖（glucose，Glu）總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high desity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low desity lipoprotein cholesterol，LDL-C）指標(biāo)。

1.3.3 DNA提取和測序

參照QIAamp FAST DNA Stool Mini Kit說明書進行糞便細(xì)菌DNA提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，使用通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16S rDNA的V4區(qū)進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。使用Agencourt AMPureXP 磁珠進行純化并溶于Elution Buffer，完成文庫構(gòu)建，使用Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測文庫的片斷范圍及濃度。應(yīng)用Illumina HiSeq2500平臺對PCR產(chǎn)物進行測序，測序類型為PE250。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

下機數(shù)據(jù)濾除低質(zhì)量的reads，獲得clean data。序列拼接使用軟件FLASH（fast length adjustment of short reads，v1.2.11），將雙末端測序得到的reads拼接成Tags，利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將優(yōu)化好的Tags在97%的相似度下聚類為操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），通過RDP classifer（v2.2）軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫比對進行物種注釋，物種復(fù)雜度分析以及利用Mothur軟件（version：1.31.2）對組間物種α-多樣性進行分析。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，結(jié)果用（）表示，組間差異比較應(yīng)用成組t檢驗進行比較分析，P≥0.05無顯著差異，0.01≤P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒對小鼠體質(zhì)量、攝食量和食物利用率的影響

由表2可知，與空白對照組相比，高脂對照組及各實驗劑量組小鼠攝食量均明顯減少，差異極顯著（P＜0.01），說明高脂飼料會抑制小鼠食欲，減少小鼠的攝食量；高脂對照組食物利用率有所提高，但差異不顯著（P＞0.05）。實驗周期內(nèi)，由于小鼠個體吸收代謝差異，高脂飲食組小鼠體質(zhì)量與空白對照組相比并無顯著差異（P＞0.05），與相關(guān)報道不一致[8]。黃酒各劑量組小鼠食物利用率明顯降低，體質(zhì)量顯著低于高脂對照組（P＜0.05）。表明黃酒對小鼠食欲有一定調(diào)節(jié)作用，小鼠體質(zhì)量增加受到抑制的現(xiàn)象是由于抑制了小鼠的食欲、減少食物的攝入而引起的，小鼠自身機體能量代謝達到平衡。

表2 各組小鼠體質(zhì)量、攝食量和食物利用率的結(jié)果Table 2 Results of body mass,food intake and food utilizing rate of mice in each group

2.2 黃酒對小鼠體內(nèi)脂肪和肝臟指數(shù)的影響

體內(nèi)脂肪質(zhì)量和脂體比是反映動物肥胖程度的重要指標(biāo)[9]。從表3實驗結(jié)果看，與空白對照組比較，高脂飼喂的各組動物脂肪質(zhì)量和脂體比均有明顯增加，表明高脂飼料能促進脂肪在小鼠體內(nèi)的堆積。與高脂對照組相比，黃酒各劑量組對小鼠體內(nèi)脂肪的總質(zhì)量減少表現(xiàn)出明顯的效果，其總脂肪質(zhì)量已接近于正常小鼠體內(nèi)的脂肪質(zhì)量，但差異不顯著（P＞0.05），表明黃酒對小鼠體內(nèi)脂肪的累積有抑制的趨勢。肝臟的質(zhì)量和肝臟指數(shù)測定結(jié)果表明，高脂飼料并未促進小鼠肝臟的增大，結(jié)合表2可知，這與小鼠食物攝入量減少，機體能量達到相對平衡的狀態(tài)，小鼠并未達到肥胖的狀態(tài)有關(guān)。但黃酒各劑量組肝臟指數(shù)與高脂對照組相比有所升高，且中劑量組差異顯著（P＜0.05），說明長期飲酒能夠?qū)е赂闻K的病變。

表3 各組小鼠脂肪質(zhì)量、脂體比、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)結(jié)果Table 3 Results of fat weight,fat to body ratio,liver weight and coefficient of mice in each group

2.3 黃酒對小鼠體內(nèi)血清水平的影響

血脂指標(biāo)與機體肥胖關(guān)系密切[10]。通過對小鼠血脂相關(guān)指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，高脂飼料能夠引起小鼠TC、TG、HCL-C和LDL-C指標(biāo)升高。與高脂對照組比較，黃酒未顯著升高小鼠血清總膽固醇含量（P＞0.05）；高密度脂蛋白含量降低，低密度脂蛋白含量升高；黃酒低劑量組和高劑量組能夠顯著降低小鼠血清中甘油三酯含量（P＜0.05），并且低于空白對照組。結(jié)果表明，適量飲用黃酒能改善高脂飲食小鼠血脂指標(biāo)異常，這與黃酒組小鼠體質(zhì)量增加緩慢，脂肪含量較低有關(guān)。但由于黃酒含糖量較高，能夠引起小鼠血糖顯著升高。

表4 各組小鼠血清指標(biāo)結(jié)果Table 4 Results of serum index of mice in each group mmol/L

2.4 黃酒對小鼠腸道菌群的影響

2.4.1 黃酒對小鼠腸道菌群多樣性的影響

腸道菌群多樣性是促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持機體免疫和新陳代謝的基礎(chǔ)，多樣性降低極易對宿主免疫產(chǎn)生影響，進而影響健康[11]。Alpha多樣性分析能反映特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的豐富度和均勻度，包括Observed-species指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)，前面4個指數(shù)越大，最后一個指數(shù)越小，說明樣品中的物種越豐富[12]。物種豐富度相同的情況下，群落中各物種均勻度越大，群落多樣性越大[13]。由表5可知，與高脂對照組比較，黃酒各劑量組腸道菌群多樣性有所提高，特別是中劑量組小鼠腸道菌群多樣性顯著提高，且逐漸接近空白對照組，由此推測黃酒能夠改善因高脂飲食導(dǎo)致的腸道菌群多樣性失衡，這可能與黃酒在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量菌群有關(guān)。結(jié)果表明，高脂飲食能降低腸道菌群的多樣性。

表5 小鼠腸道菌群α-多樣性統(tǒng)計分析Table 5 Alpha diversity statistical analysis of gut microbiota in mice

2.4.2 黃酒對小鼠腸道菌群組成的影響

本研究使用偏最小二乘判別分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA）模型對各組小鼠腸道菌群組成差異進行分析。PLS-DA是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計分析方法，常用來判斷研究對象如何分類。由圖1A和圖1B基于操作分類單元（OTU）的主坐標(biāo)分析結(jié)果可知，基礎(chǔ)飼料飼喂和高脂飼料飼喂的小鼠腸道菌群的數(shù)據(jù)點表現(xiàn)出各自聚集的情況，黃酒各劑量組與高脂模型組小鼠腸道菌群的數(shù)據(jù)點同樣表現(xiàn)出各自聚集的情況。說明飲食干預(yù)影響了小鼠腸道菌群的組成，這可能與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及能量代謝水平差異有關(guān)。

圖1 不同飲食組（a）、高脂飲食組（b）小鼠腸道菌群偏最小二乘判別分析Fig.1 Principal coordinate analysis of gut microbiota in mice with different diet (a) and high-fat diet (b)

2.4.3 黃酒對小鼠腸道菌群門水平的影響

在門分類水平上，對小鼠腸道菌群組成的分析發(fā)現(xiàn)，各組小鼠優(yōu)勢菌由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和藍藻菌門（Cyanobacteria）組成。如圖3所示，與空白對照組相比，高脂飲食組小鼠擬桿菌門、厚壁菌門含量分別降低8%和14%，變形菌門和藍藻菌門含量分別升高30%和20%，脫鐵桿菌門（Deferribacteres）含量升高2倍，疣微菌門（Verrucomicrobia）含量高出近11倍。

厚壁菌門和擬桿菌門是腸道菌群中影響能量代謝平衡的兩個主要群落，研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門的含量和比例與宿主的身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）有關(guān)[14-16]。本研究中，由于高脂飲食組動物日均攝食量顯著降低，導(dǎo)致實驗結(jié)束后動物體質(zhì)量有所降低，高脂飲食組動物腸道菌群厚壁菌門和擬桿菌門的比例為28%，低于空白對照組的33%，與文獻報道研究結(jié)果一致。

與高脂對照組比較，黃酒高劑量組厚壁菌門和擬桿菌門相對含量分別降低12%和11%，二者比例降低7%，疣微菌門和脫鐵桿菌門含量顯著上升，而黃酒中劑量組各優(yōu)勢菌群含量接近空白對照組，表明黃酒能夠改善高脂飲食引起的腸道菌群門水平豐度。

圖2 各組小鼠腸道菌群在門水平上的注釋結(jié)果Fig.2 Annotation results of gut microbiota in each group of mice at phylum level

2.4.4 黃酒對小鼠腸道菌群種水平的影響

圖3 各組小鼠腸道菌群在種水平上的注釋結(jié)果Fig.3 Annotation results of gut microbiota in each group of mice at species level

由圖3可知，在種分類水平上各組小鼠腸道菌群能夠注釋到的物種主要包括Parabacteroides gordonii、Mucispirillum schaedleri、Akkermansia muciniphila、火氏副擬桿菌（Parabacteroides distasonis）、生酸擬桿菌（Bacteroides acidifaciens）等菌種。與空白對照組比較，高脂對照組Parabacteroides distasonis相對含量降低53%，而黃酒組該菌含量較高脂組平均升高126%，結(jié)合表2和表4結(jié)果推測，黃酒能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群種水平豐度抑制因高脂飲食引起的脂肪含量堆積，進而改善血脂異常。有研究表明，Parabacteroides distasonis是人體核心菌群之一，其含量與肥胖、非酒精性脂肪肝、糖尿病等疾病狀態(tài)呈顯著負(fù)相關(guān)[17-19]，WANG K等[20]研究發(fā)現(xiàn)，該菌可以顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)肥胖模型小鼠的肥胖、胰島素抵抗、脂代謝紊亂。Parabacteroides distasonis通過產(chǎn)生琥珀酸、次級膽酸激活不同信號通路，發(fā)揮多靶點整體調(diào)節(jié)作用，是一種潛在、新型抗代謝綜合癥益生菌。

3 結(jié)論

黃酒能夠通過抑制小鼠的食欲減少小鼠的攝食量，進而降低因高脂飲食引起的脂肪含量堆積，減緩體質(zhì)量的增長。適量飲用黃酒能夠改善因高脂飲食引起的相關(guān)血脂指標(biāo)異常，但長期飲酒，可能會引起血糖升高和肝臟病變。黃酒能夠改善高脂飲食小鼠腸道菌群的多樣性，在種水平豐度上，黃酒能提高因高脂飲食導(dǎo)致的Parabacteroides distasonis含量降低，對高脂飲食小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有促進作用。