嚴(yán)華，張慧秀，白宗利，樂智勇，魏鋒*，馬雙成*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.康美藥業(yè)股份有限公司，北京 102629

西洋參PanaxquinquefoliusL.、人參PanaxginsengC.A.Mey和三七PanaxnotoginsengF.H.Chen均為五加科人參屬的名貴中藥材，收載于歷版的《中華人民共和國藥典》，各有明確的功效[1]：西洋參補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津；人參大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津、安神；三七散瘀止血、消腫定痛。近年來三者又陸續(xù)列入藥食同源的植物品種目錄，現(xiàn)已出現(xiàn)在糕點(diǎn)、糖、茶等食品中。人參在進(jìn)入衛(wèi)生部新資源食品的同時有加以說明，必須為栽培5年以下的人工種植人參，而藥用人參通常參齡為5年以上[2-3]，西洋參、三七藥用種植規(guī)范規(guī)定，西洋參為栽培4年可采收[4]，三七栽培3年可采收。此外三七按采收時間分春三七和冬三七兩種規(guī)格，春三七通常10月份采收，此時采收的三七產(chǎn)量高、飽滿、質(zhì)量佳，冬三七為留籽后采收，飽滿程度及質(zhì)量不及前者[5]，由此，市場出現(xiàn)大量不足栽培年限的西洋參、人參、三七，影響了藥材的質(zhì)量。此外由于三者為同科同屬植物，有很多相同的成分，在價格波動情況下，常易發(fā)生替代或摻雜使用的現(xiàn)象[6]，尤其是加工成飲片后。為鑒別比較3種藥材，以及不同栽培年限的成分分布狀況，擬從成分上加以分析比較?，F(xiàn)行《中華人民共和國藥典》中3種藥材各自有成分相關(guān)的檢測方法，包括薄層鑒別及含量測定，但從提取方法到測定條件各不相同，在鑒定一個未知藥材，如藥材粉末時，需通過多次實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)過程繁瑣。本研究通過采用地道的西洋參、人參及三七藥材建立適用于同時鑒別三者的HPLC特征圖譜，通過特征圖譜的比較、相似度及主成分分析，以及3種藥材共有皂苷成分峰面積的比值關(guān)系，達(dá)到了既可鑒別藥材品種，又可區(qū)分不同生長年限藥材的目的，方法專屬性強(qiáng)，分析時間比現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的HPLC含量測定方法時間縮短一倍，分離效果好。建議質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在此3種同科同屬藥材的鑒別上采用統(tǒng)一的特征圖譜鑒別方法及含量測定方法，提高檢驗(yàn)效率。

1 材料

1.1 儀器

Waters2695-2996系列液相色譜儀(包括高精度四元梯度泵、真空在線脫氣機(jī)、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站等)；Alltech ES2000蒸發(fā)光散射檢測器；超聲波清洗儀(功率：250 W，頻率：40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)。

ChemPattern化學(xué)計(jì)量分析軟件[科邁恩(北京)科技有限公司]2.0版本，下文簡稱指紋圖譜軟件。

1.2 試劑

人參皂苷Rg1對照品(批號：110703-201530，純度：92.4%)、人參皂苷Re對照品(批號：110754-201525，純度93.4%)、人參皂苷Rb1對照品(批號：110704-201424，純度91.2%)、人參皂苷Rd對照品(批號：111818-201302，純度92.1%)、人參皂苷Rf對照品(批號：111719-201505，純度90.0%)、擬人參皂苷F11對照品(批號：110841-201607)、三七皂苷R1對照品(批號：110745-201820，純度93.1%)，西洋參對照藥材(批號：120997-201309)、人參對照藥材(批號：120917-201712)、三七對照藥材(批號：120941-201409)均由中國食品藥品檢定研究院提供；人參皂苷Rc對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：11021-14-0，純度>98%)；乙腈為色譜純(Fisher Chemical)；甲醇等試劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司)；水為MILLI-Q去離子水(25 ℃，18 Ω，密理博公司)。

1.3 樣品

西洋參P.quinquefoliusL.總計(jì)115批樣品，其中栽培4年生的樣品73批，2年生、3年生樣品各21批；人參P.ginseng總計(jì)80批，其中5年生樣品20批，3～4年及6年生樣品各20批；三七P.notoginseng總計(jì)44批樣品，包括春三七、冬三七兩種規(guī)格，前者24批、后者20批，各樣品的產(chǎn)地信息詳見表1，由康美藥業(yè)股份有限公司種植基地及中國食品藥品檢定研究院提供，經(jīng)本論文作者嚴(yán)華鑒定。樣品粉碎，過四號篩，分別測定水分，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

分別取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc、Rb3、Rd、Rf對照品、擬人參皂苷F11和三七皂苷R1，共10種對照品，分別加甲醇溶解，制成每1 mL含0.5 mg溶液作為對照品母液，再分別精密吸取各對照品母液2 mL，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品粉末1.0 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，搖勻，稱定質(zhì)量，靜置1 h，超聲提取30 min，放置至室溫，稱質(zhì)量，以甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，取通過微孔濾膜(0.45 μm)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Grace C8色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫：0～10 min，20%A；10～11 min，25%A；11～33 min，33%A；33～38 min，46%A；38～40 min，80%A；40～45 min，100%A；46 min，20%A；流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，蒸發(fā)光散射儀溫度為110 ℃，氮?dú)饬魉贋?.5 L·min-1，理論板數(shù)按人參皂苷Rb1計(jì)算應(yīng)不低于5000，進(jìn)樣量10～20 μL。

2.4 特征圖譜的建立

2.4.1 西洋參特征圖譜及與不同栽培年限品的比較 西洋參4年生樣品粉末73批，分別精密稱定，照2.2項(xiàng)供試品溶液制備方法制成西洋參供試品溶液，照2.3色譜條件注入液相色譜儀，記錄60 min HPLC圖，圖譜以AIA文件格式導(dǎo)入指紋圖譜分析軟件，以西洋參對照藥材為代表樣品，其他所有圖譜之比對，擬合成11個共有峰模式的特征圖譜，見圖1A疊加圖及圖2A特征圖譜，利用夾角余弦法計(jì)算特征圖譜的相似度，結(jié)果在0.86～0.99，相似性良好。2年生、3年生樣品圖譜與特征圖譜比較，相似度結(jié)果分別在0.56～0.90和0.81～0.96，2年生樣品圖譜相似度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可與4年生樣品顯著區(qū)分，3年生樣品圖譜與特征圖譜從相似度上不易區(qū)分。樣品信息及相似度結(jié)果詳見表1第Ⅰ～Ⅲ組樣品，圖譜見圖3。

注：R.混合對照品；1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Re；4.人參皂苷Rf；5.人參皂苷Rb1；6.人參皂苷Rc；7.人參皂苷Rb2；8.人參皂苷Rb3；9.人參皂苷Rd；A.西洋參，由上至下為美國產(chǎn)、加拿大產(chǎn)、吉林集安產(chǎn)、遼寧丹東產(chǎn)、陜西留壩產(chǎn)；B.人參；C.三七。圖1 混合對照品及符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定栽培年限西洋參、人參、三七HPLC圖

注：A.西洋參，1～11為特征峰；B.人參，1～9為特征峰；C.三七，1～10為特征峰。圖2 西洋參、人參、三七HPLC特征圖譜

圖3 不足栽培年限西洋參HPLC圖譜

表1 西洋參、人參、三七特征圖譜樣品信息及相似度、峰面積比值計(jì)算結(jié)果

2.4.2 人參特征圖譜及與不同栽培品的比較 取人參5年生樣品20批，分別精密稱定，同西洋參特征圖譜建立方法，以人參對照藥材為代表樣品，其他所有圖譜與之比對，擬合成9個共有峰模式的人參特征圖譜，見圖1B疊加圖及圖2B特征圖譜，相似度結(jié)果在0.86～0.99，相似性良好。4年生、6年生圖譜的相似度結(jié)果分別在0.89～0.97和0.88～0.98，從相似度不易區(qū)分；3年生相似度結(jié)果在0.43～0.92，與特征圖譜相似度差異較大，可與特征圖譜區(qū)分，樣品信息及相似度結(jié)果詳見表1第Ⅵ～Ⅶ組，圖譜見圖4。

注：由上至下依次為3年生、4年生、6年生人參圖4 3年生、4年生、6年生人參HPLC圖譜

2.4.3 三七特征圖譜及與冬三七的比較 取春三七樣品粉末24批，分別精密稱定，同西洋參特征圖譜建立方法，以三七對照藥材為代表樣品，其余樣品與之比對，擬合成10個特征峰的三七特征圖譜，見圖1C疊加圖及圖2C特征圖譜；相似度結(jié)果在0.96～1.00，圖譜相似性良好。冬三七圖譜與特征圖譜比較相似度結(jié)果分別在0.89～0.97相似度均不易區(qū)分。樣品信息及相似度結(jié)果詳見表1第Ⅷ～Ⅸ組，圖譜見圖5。

圖5 冬三七HPLC圖譜

2.4.4 特征峰的確認(rèn) 樣品圖譜按峰面積占總峰面積2%積分處理，西洋參擬合成11個特征峰，經(jīng)與對照品色譜峰比對，并結(jié)合DAD光譜，確認(rèn)人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc和人參皂苷Rd峰；同法對人參擬合，共有模式有9個特征峰，確認(rèn)人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd峰；三七擬合成10個特征峰，確認(rèn)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd；可見三者的特征成分分別為人參皂苷Rc、人參皂苷Rf、三七皂苷R1，共有成分有4個，為人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd。

2.5 方法學(xué)研究

2.5.1 精密度 精密吸取同一批西洋參(批號：XYS-0401)供試品溶液20 μL，上述方法制備供試液，按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，分別記錄色譜圖。以人參皂苷Rb1為參照峰，計(jì)算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果各特征峰的相對保留時間的RSD<1.2%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<2%，相似度評價結(jié)果為0.98，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性 精密吸取同一批西洋參(批號：XYS-0401)供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以人參皂苷Rb1為參照峰，計(jì)算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果各特征峰的相對保留時間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<2%，計(jì)算相似度結(jié)果為0.99，表明西洋參供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。同法操作，取同一批次的人參(批號：RS0401)、三七(批號：SQ-051)供試品溶液，同法操作，結(jié)果人參和三七特征圖譜中各特征峰的相對保留時間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<2%，相似度分別為0.98和0.99，表明人參、三七供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好。

2.5.3 重復(fù)性 取同一批西洋參(批號：XYS-0401)樣品粉末6份，精密稱定，同時制備6份供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液20 μL，上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以人參皂苷Rb1為參照峰，計(jì)算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果各特征峰的相對保留時間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<2%，計(jì)算相似度為0.95，表明該方法檢測西洋參時重復(fù)性良好。同法操作，分別取人參(批號：RS0401)、三七(批號：SQ-051)制備供試品溶液，注入液相色譜儀進(jìn)樣測定，特征圖譜結(jié)果顯示，各特征峰的相對保留時間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD均<2%，表明該方法檢測人參、三七時均具有良好的重復(fù)性。

2.5.4 西洋參不同栽培年限的比較 取2年生、3年生西洋參樣品照2.2項(xiàng)方法制備供試液，照2.3色譜條件記錄色譜圖，照2.4方法采用化學(xué)計(jì)量分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。相似度計(jì)算結(jié)果在0.56～0.90，與特征圖譜相似度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主成分分析圖可見2年生樣品區(qū)域與特征圖譜區(qū)域不相交，可顯著區(qū)分從而達(dá)到鑒別的目的，但3年生樣品相似度在0.81～0.96，與特征圖譜較近似，主成分分析圖上可見3年生樣品介于2年生組與4年生組之間，區(qū)分不顯著，見圖3。

2.5.5 人參不同栽培年限的比較 取3年生、5年生、6年生人參樣品圖譜，采用化學(xué)計(jì)量分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，相似度計(jì)算結(jié)果分別在0.43～0.92、0.89～0.97、0.88～0.98，3年生樣品與特征圖譜相似度低，5年生、6年生與特征圖譜相似度高；主成分分析圖可見3年生樣品區(qū)域與特征圖譜區(qū)域相距遠(yuǎn)，幾乎不相交，說明3年生人參與采收期的人參差別顯著，可達(dá)到區(qū)分鑒別的目的，5年生、6年生樣品與4年生樣品主成分分析結(jié)果聚在一起，未見顯著區(qū)別，見圖4，較符合現(xiàn)行的種植標(biāo)準(zhǔn)。

2.5.6 三七不同規(guī)格的比較 取冬三七樣品圖譜采用化學(xué)計(jì)量分析軟件數(shù)據(jù)處理，相似度計(jì)算結(jié)果在0.98～1.00，相似性高；主成分分析圖可見兩者主成分區(qū)域有相交處，但也有較明顯的差異，可聚在兩個不同的區(qū)域內(nèi)，見圖5。春三七是打去花蕾，在七月收獲的，體重色好，產(chǎn)量高，傳統(tǒng)上認(rèn)為質(zhì)量佳，冬三七是結(jié)籽后起收的，體大質(zhì)松，除有計(jì)劃留籽外，傳統(tǒng)上不宜采收冬三七，可見兩者是有差異的。

2.5.7 西洋參、人參、三七的比較 本方法建立的西洋參、人參、三七特征圖譜相似度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。西洋參特征峰為人參皂苷Rc，人參特征峰為人參皂苷Rf，三七特征峰為三七皂苷R1，此外其他峰的數(shù)量及峰面積差異顯著，若以西洋參特征圖譜為代表性樣品，相似度以1計(jì)，人參、三七的相似度分別在0.38～0.54、0.26～0.43，與西洋參相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可鑒別3種藥材；主成分分析顯示，三者各自聚在3個不相交的區(qū)域內(nèi)，見圖6；特征圖譜中人參皂苷Rg1、Re峰形因品種差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者的峰面積的比值對于藥材的鑒定具有顯著意義，西洋參2～4年生該比值在0.03～0.64，即比值<0.7，人參3～6年生該比值在0.91～3.07，即Rg1峰面積>0.9，三七該比值在6.03～26.81，即Rg1峰面積遠(yuǎn)高于Re峰面積，達(dá)6倍以上，詳見表1。

圖6 不同栽培年限西洋參主成分分析圖

圖7 不同栽培年限人參主成分分析圖

圖8 不同規(guī)格三七主成分分析圖

圖9 西洋參、人參、三七主成分分析圖

3 討論

3.1 樣品的選擇

西洋參、人參、三七藥材的產(chǎn)地、規(guī)格、品種繁多，復(fù)雜，建立特征圖譜的樣品均符合道地藥材、采收季節(jié)，且按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測各項(xiàng)指標(biāo)合格以保證特征圖譜的代表性、準(zhǔn)確性。

3.2 提取方法的選擇

西洋參、人參、三七為同屬不同種植物，含有很多相近的成分，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)含量測定項(xiàng)下采用的樣品前處理方法各不相同，西洋參樣品前處理采用水飽和的正丁醇加熱回流1.5 h，蒸干濾液，以50%甲醇定容的方法。人參為樣品粉末置索氏提取器中，先以三氯甲烷回流3 h，棄去三氯甲烷液，揮干，再以水飽和的正丁醇浸泡過夜，超聲處理30 min，蒸干濾液，以甲醇定容的方法。三七采用樣品粉末加甲醇浸泡過夜，80 ℃水浴回流2 h的提取方法，各方法均非常繁瑣，為了比較3種藥材中成分分布狀況，必須建立相同的前處理方法，筆者研究了中國香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)及美國、歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)，分別考察了以50%、80%、100%甲醇為溶劑，浸泡過夜超聲、浸泡2 h后超聲及浸泡2 h后回流的方法，結(jié)果采用適用于3種藥材的提取方法，即樣品粉末加甲醇，浸泡2 h，超聲提取30 min的方法，與原方法比較，縮短提取時間，更多地保留了成分信息，有利于為主成分分析提供更多數(shù)據(jù)，方法學(xué)驗(yàn)證樣品溶液穩(wěn)定。

3.3 色譜柱的選擇

本研究采用C8色譜柱代替了現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用的C18色譜柱，達(dá)到了更有效地多種難分離成分的目的[7]，如對同分異構(gòu)體人參皂苷Rb2和人參皂苷Rb3、人參皂苷Rf與擬人參皂苷F11的分離。擬人參皂苷F11為西洋參的一個特征成分，而人參皂苷Rf為人參的一個特征成分，雖然在紫外光(203 nm)下擬人參皂苷F11吸收弱，不影響人參皂苷Rf的檢測，但在蒸發(fā)光散射檢測擬人參皂苷F11時，以C18色譜柱檢測時易受人參皂苷Rf的干擾，不僅影響擬人參皂苷F11的含量測定，且易發(fā)生在西洋參中檢出人參皂苷Rf的風(fēng)險(xiǎn)。

3.4 檢測方法的選擇

樣品測定過程中采用了液相色譜-紫外光-蒸發(fā)光散射(HPLC-UV-ELSD)聯(lián)用的檢測方法，以考察某些無紫外吸收的成分的特征圖譜狀況，如擬人參皂苷F11，結(jié)果ELSD檢測未發(fā)現(xiàn)各藥材的特有成分，而紫外檢測條件基線穩(wěn)定，更易操作，故選擇紫外光(203 nm)檢測條件下的特征圖譜進(jìn)行樣品的分析研究。

3.5 流動相的選擇

為考察3種藥材中化學(xué)成分的分布，必須在同一色譜條件下進(jìn)行分析，本研究在現(xiàn)行國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上，綜合考慮了西洋參、人參及三七3種藥材的多項(xiàng)成分，建立了特征圖譜色譜條件，采用乙腈-水替代標(biāo)準(zhǔn)方法中的磷酸溶液[8-9]，既有利于環(huán)保，又利于蒸發(fā)光散射器的安全使用，且較現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的色譜分析條件大幅度地縮短了測定時間，由標(biāo)準(zhǔn)方法的近2 h，縮短至1 h，良好分離了9種以上可確定的皂苷成分。

3.6 共有峰的確認(rèn)

3種藥材除人參皂工Rg1、Re、Rb1、Rd外，人參皂苷Rb2、Rb3亦為三者共有，但二者在總皂苷中含量極低，主成分分析對三者鑒別以及不同栽培年限樣品比較的貢獻(xiàn)載荷均極小，故忽略未計(jì)。

4 小結(jié)

西洋參、人參和三七為同屬不同種植物，藥效確切，應(yīng)用廣泛，目前雖對皂苷、多糖、微量元素、礦物質(zhì)等類成分有廣泛的研究，但確切的物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確，皂苷類成分入手對于不同產(chǎn)地、不同栽培年限確有明確的鑒別意義，故本研究采用已知成分為皂苷類成分為指標(biāo)，建立了在相同的樣品前處理、色譜分析條件下的特征圖譜，分析比較了不同栽培期西洋參、人參、三七的成分差異，特有成分和共性成分，并從人參皂苷Rg1、Re的比值關(guān)系為三者的品種鑒別及質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。