韋瑩 余麗瑩 黃雪彥 繆劍華 韋樹根 董青松 秦雙雙 黃寶優(yōu)
摘要:以兩面針[Zanthoxylum nitidum (Roxb.)DC.]帶芽嫩莖為外植體,研究了不同抗褐化劑對兩面針組織培養(yǎng)中試管苗褐化的抑制效果。結(jié)果表明,在初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加1.0 g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP),外植體褐化程度輕,萌發(fā)率最高,為62.50%。3種添加抗褐化劑組合對試管苗抗褐化均起到一定抑制作用,添加PVP處理效果最理想,PVP濃度為1.0 g/L時(shí),試管苗褐化率僅為11.67%,增殖系數(shù)為5.03,其次為活性炭(AC),抗壞血酸(維生素C)的抗褐化效果不明顯。
關(guān)鍵詞:兩面針[Zanthoxylum nitidum (Roxb.)DC.];莖段;組織培養(yǎng);試管苗;抗褐化
中圖分類號:S853.75? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A
文章編號:0439-8114(2019)22-0194-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.044? ? ? ? ? ?開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識碼(OSID):
Study on anti-browning and stem tissue culture of Zanthoxylum nitidum (Roxb.)DC.
WEI Ying,YU Li-ying,HUANG Xue-yan,MIAO Jian-hua,WEI Shu-gen,
DONG Qing-song,QIN Shuang-shuang,HUANG Bao-you
(Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants,Nanning 530023,China)
Abstract: Tender stems were used as explants, to discuss the effects of different anti-browning agents on the browning of plantlets in tissue culture of Zanthoxylum nitidum. The results showed that when adding 1.0 g/L PVP in first culture medium, the explants were light browning, The highest budding rate was 62.50%. Three combinations of adding anti-browning agent played a role in inhibiting browning on test tube plantlet,The best result was to add PVP. The browning rate was 11.67% in the presence of PVP was 1.0 g/L, the multiplication coefficient was 5.03,followed by AC,the anti browning effect of Vc was not obvious.
Key words: Zanthoxylum nitidum (Roxb.)DC.; stems; tissue culture; test tube plantlet; anti-browning
兩面針[Zanthoxylum nitidum (Roxb.)DC.]系蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum)木質(zhì)藤本植物,廣泛分布于廣東、廣西、云南、貴州、四川、湖南、臺灣、福建、浙江等省,生長于山野坡地灌木叢中,資源豐富、應(yīng)用廣泛[1]。兩面針為中國南方地區(qū)的常用中藥,具祛風(fēng)活血、解毒消腫,散淤止痛之功能。常用于治療胃痛、牙痛、神經(jīng)痛、風(fēng)濕骨痛、毒蛇咬傷等多種病癥[2],此外也應(yīng)用于抗癌、潔齒,是三九胃泰、正骨水、跌打萬花油等著名中成藥和日用品兩面針中藥牙膏的主要原料[3]。
隨著人們對兩面針?biāo)幉男枨罅咳找嫔遊4],加上生境破壞和不合理采挖,其野生資源瀕臨枯竭,因此市場上兩面針?biāo)幉牡膫纹芬草^多[5],難以滿足市場需求。兩面針生藥、成分、藥理、臨床等方面的研究,已取得一定進(jìn)展[6],關(guān)于組織培養(yǎng)方面的研究不多[7-9],至今未有兩面針試管苗抗褐化相關(guān)報(bào)道。植物組織培養(yǎng)具有繁殖速度快、繁殖率高的特點(diǎn),但在兩面針組織培養(yǎng)中,試管苗出現(xiàn)菌類污染、玻璃化、褐化等問題。褐化主要發(fā)生在莖段初代誘導(dǎo)及試管苗繼代培養(yǎng)過程中,接觸培養(yǎng)基部位、整個(gè)植株均出現(xiàn)不同程度褐化,嚴(yán)重影響了兩面針試管苗的質(zhì)量和繁育。本試驗(yàn)在前期組培研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了維生素C、活性炭(AC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 3種抗褐化劑對兩面針褐化的抑制效果,旨在為工廠化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗提供參考依據(jù)。
1? 材料與方法
1.1? 試驗(yàn)材料
2011年11月從廣西龍州引種種植于廣西藥用植物園繁育圃,經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園余麗瑩研究員鑒定該品種為兩面針,采摘無病蟲害植株的幼嫩帶芽莖段作為試驗(yàn)材料。
1.2? 儀器與試劑
AIR TECH超凈工作臺,立式壓力蒸汽滅菌鍋,EL電子天平,電磁爐,pH酸度計(jì),滅菌器等。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP),活性炭(AC),抗壞血酸(維生素C),奈乙酸﹙NAA﹚,6-芐基腺嘌呤(6-BA)等。
1.3? 方法
1.3.1? 莖段滅菌與誘導(dǎo)? 取兩面針幼嫩帶芽莖段,用洗潔精水溶液清洗表面污垢,流水沖洗5~8 min,再用75%乙醇溶液表面滅菌30 s,然后在0.1%氯化汞溶液中分別滅菌8、10、12 min,無菌水沖洗3~5次。
1.3.2? 不同抗褐化劑對兩面針外植體誘導(dǎo)的比較? 用滅菌好的接種工具將嫩芽兩端切掉,將長為1.2~1.5 cm的帶芽莖段分別接種于不同培養(yǎng)基①M(fèi)S+NAA 0.1 mg/L+6-BA1.0 mg/L;②MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+維生素C 1.0 g/L;③MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L;④MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+AC 1.2 g/L培養(yǎng)基上,觀察并記錄褐化、萌發(fā)情況,每瓶接種3個(gè)莖段。每個(gè)處理接種8瓶。
1.3.3? 不同抗褐化劑對兩面針試管苗生長的比較? 將兩面針試管苗剪切成1.2~1.5 cm的帶芽莖段,接種到MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L及維生素C、PVP、AC不同濃度組合培養(yǎng)基中,其中抗褐化劑濃度分別為維生素C(0.2、0.5、1.0、1.5 g/L)、PVP(0.5、1.0、1.5、2.0 g/L)、AC(0.5、0.8、1.2、1.5 g/L),觀察并記錄褐化及萌發(fā)情況,每瓶接種6個(gè)莖段。每個(gè)處理接種10瓶。
1.4? 統(tǒng)計(jì)方法
萌芽率=萌發(fā)芽數(shù)/接種外植體數(shù)×100%;褐化率=褐化外植體(苗)的塊、株數(shù)/接種總數(shù)×100%。
1.5? 培養(yǎng)條件
培養(yǎng)溫度(25±2) ℃,光照度2 000 lx,光照時(shí)間12 h/d。
2? 結(jié)果與分析
2.1? 不同抗褐化劑對兩面針外植體誘導(dǎo)的影響
以帶芽莖段為外植體,接種于添加不同濃度抗褐化劑處理的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,比較不同抗褐化劑對外植體褐化及誘導(dǎo)情況的影響,結(jié)果如表1所示,處理1外植體接種5 d,切口開始出現(xiàn)輕微的褐色,培養(yǎng)7 d,接觸培養(yǎng)基部位出現(xiàn)少量污染和褐化現(xiàn)象(圖1),添加抗褐化劑的3個(gè)處理褐化情況差異較大,4個(gè)初代誘導(dǎo)處理中,以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L(處理3)生長調(diào)節(jié)劑組合對外植體抗褐化效果較為理想,褐化時(shí)間較晚,培養(yǎng)10 d出現(xiàn)輕微褐化,培養(yǎng)30 d,褐化率和萌發(fā)率分別為16.67%和62.50%,芽體嫩綠,長勢好。
2.2? 不同抗褐化劑對兩面針試管苗生長及防褐化效果的影響
2.2.1? 不同濃度維生素C對兩面針試管苗褐化的影響? 在組織培養(yǎng)過程中,維生素C具有防止組織變褐的作用。由表2可以看出,抗褐化劑維生素C對兩面針試管苗有一定的防褐化作用,在濃度為1.0~1.5 g/L時(shí)效果比較理想,培養(yǎng)60 d后,褐化率最低為20.00%,苗增殖系數(shù)最高為3.58,株壯、葉綠,苗長勢好,低濃度的維生素C對試管苗生長效果差,試管苗在培養(yǎng)15 d接觸培養(yǎng)基部位開始出現(xiàn)褐化(圖2),隨后整個(gè)植株褐化,試管苗出現(xiàn)玻璃化、葉片枯黃和凋落的現(xiàn)象(圖3)。
2.2.2? 不同濃度PVP對兩面針試管苗褐化的影響? PVP是一種水溶性物質(zhì),通過氫鍵與酚類物質(zhì)結(jié)合,減少酚類物質(zhì)的毒害,起到減輕褐化的作用。由表3可以看出,PVP對減少褐化情況有明顯的效果,隨著PVP濃度的升高,褐化得到控制,而且試管苗增殖系數(shù)均達(dá)到4.00以上,但是濃度過高,則會影響試管苗的增殖,甚至出現(xiàn)試管苗玻璃化的現(xiàn)象,4個(gè)不同濃度PVP均能在一定程度上起到抑制褐化的作用,當(dāng)PVP濃度為0.5 g/L時(shí),褐化率最高為21.67%;PVP濃度為1.0 g/L時(shí)抗褐化效果最佳,褐化率和增殖系數(shù)分別為11.67%和5.03。PVP抗褐化組合培養(yǎng)基培養(yǎng)的試管苗褐化發(fā)生時(shí)間較晚,25 d開始出現(xiàn)褐化,且褐化程度輕。
2.2.3? 不同濃度AC對兩面針試管苗褐化的影響? AC具有吸附特性,在試管苗繼代增殖培養(yǎng)過程中,添加適當(dāng)濃度活性炭對試管苗褐化起到一定抑制作用。由表4可見,活性炭濃度為0.5 g/L時(shí)褐化比較嚴(yán)重,且出現(xiàn)葉片枯黃凋落情況,褐化率最高,為25.00%;活性炭濃度為1.2 g/L時(shí),褐化率和增殖系數(shù)分別為15.00%和4.53,株壯葉綠,隨著濃度的進(jìn)一步升高,試管苗褐化和增殖效果不理想。
3? 結(jié)論與討論
褐化是外植體由于自身分泌的酚類化合物的影響導(dǎo)致外植體褐變,是植物組織培養(yǎng)中一種常見的現(xiàn)象,直接影響到組織培養(yǎng)能否取得成功,褐化問題是植物組織培養(yǎng)中最常見的三大問題之一[10,11]。目前還未發(fā)現(xiàn)避免褐化的特效方法,科研人員根據(jù)不同植物采用不同試驗(yàn)手段,篩選出防止褐變的發(fā)生或者減輕褐變造成危害的最佳方法[12-15]。
兩面針為木質(zhì)藤本植物,進(jìn)行初代誘導(dǎo)及試管苗增殖培養(yǎng)容易發(fā)生嚴(yán)重褐化。本試驗(yàn)探討兩面針組培過程抗褐化的方法,通過從莖段誘導(dǎo)、添加抗褐化劑等方面,總結(jié)兩面針組培快繁過程中防褐化的相關(guān)技術(shù),旨在促進(jìn)兩面針組培快繁技術(shù)的優(yōu)化,為推廣優(yōu)質(zhì)種苗提供技術(shù)參考。
采用連續(xù)轉(zhuǎn)移初代誘導(dǎo)材料(試管苗)、暗培養(yǎng)方法進(jìn)行抗褐化研究,發(fā)現(xiàn)效果不明顯,隨后通過在培養(yǎng)基中添加維生素C、PVP、AC進(jìn)行防褐化試驗(yàn)。結(jié)果表明,3種抗褐化組合在一定程度上均能控制褐化,明顯比不添加抗褐化劑的處理效果好。其中添加PVP濃度為1.0 g/L的處理褐化程度較輕,試管苗長勢良好,增殖系數(shù)最高,而添加AC和維生素C的處理褐化圈較大,顏色較濃,試管苗長勢及增殖效果稍差。
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