唐立海，朱壽光，林蔚文

（廣東省東莞市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 東莞 523808）

骨筋丸膠囊由乳香、沒藥、血竭等14味中藥組成，具有活血化瘀、舒筋通絡(luò)、祛風(fēng)止痛的功效。目前骨筋丸膠囊沿用的是《中藥成方制劑》第十三冊標(biāo)準(zhǔn)［1］、《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編：骨傷科分冊》［2］及相關(guān)藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)（國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS3-B-2571-97-3、WS3-B-2571-97-6、WS3-B-2571-97-9、WS3-B-2571-97-12），除個別廠家注冊標(biāo)準(zhǔn)有檢測血竭含量外，其余均沒有檢測血竭的含量。在日常抽檢檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，市場上大量存在以龍血竭冒充血竭使用的情況。血竭具有活血定痛，化瘀止血，生肌斂瘡功效，是骨筋丸膠囊中重要組成成分，目前我國血竭完全依賴從東南亞進(jìn)口，價格昂貴，質(zhì)量參差不齊。因此，在骨筋丸膠囊現(xiàn)有的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中增加血竭的含量測定，可以得出企業(yè)是否使用偽品投料、少投料、不投料等情況，滿足監(jiān)督生產(chǎn)企業(yè)對血竭投料不足或者使用劣質(zhì)血竭投料等情況?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津公司，型號：LC-20A）；色譜柱［資生堂（中國）投資有限公司，型號：MGII，4.6 mm×250 mm，5 μm］。

1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；磷酸等其他試劑為分析純。

1.3 試藥 骨筋丸膠囊 （黑龍江省濟(jì)仁藥業(yè)有限公司，批號：180101）；骨筋丸膠囊血竭陰性對照品（陜西君碧莎制藥有限公司，批號：20181021）；血竭素高氯酸鹽對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號：110811-201707，含量 96.3%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的考察

2.1.1 對照品溶液的制備 取血竭素高氯酸鹽對照品10 mg，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，加9%磷酸甲醇溶液（取9 mL磷酸，加水定容至100 mL，下同）稀釋至刻度，搖勻，再精密量取2 mL置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 檢測波長掃描 參照《中華人民共和國藥典（一部）》［3］2015 年版“血竭含量測定”項(xiàng)下的血竭素高氯酸鹽的檢測波長，測定波長選擇定為440 nm。

2.1.3 流動相的選擇 《中華人民共和國藥典（一部）》［3］2015 年版收載“血竭含量測定”項(xiàng)下的流動相為乙腈-0.05 mol／L 磷酸二氫鈉溶液（50∶50）。在此基礎(chǔ)上，改變流動相的比例，選擇血竭素高氯酸鹽分離度、保留時間較適中的乙腈-0.05 mol／L磷酸二氫鈉溶液配比（30∶70），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 1。

2.2 供試品溶液提取條件的優(yōu)化 通過比較試驗(yàn)，選定的提取條件為：以9%磷酸甲醇25 mL為提取溶劑，超聲處理（功率240 W，頻率 40 kHz）30 min。

2.2.1 提取溶劑的選擇 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（磷酸甲醇濃度為1%、3%、6%、9%、12%時，面積積分值分別為441 323、534 766、742 861、764 072、765 319）表明：血竭素高氯酸鹽的提取效率與提取溶劑中磷酸的濃度有關(guān)，當(dāng)磷酸的濃度從1%逐漸提高至9%時，血竭素高氯酸鹽的含量逐漸提高，當(dāng)磷酸濃度提高至12%時，血竭素高氯酸鹽的含量不再提高，同時考慮磷酸甲醇的濃度太高，酸性太強(qiáng)，對儀器與色譜柱有損壞，故選擇9%磷酸甲醇作為提取溶劑。同時進(jìn)樣溶液用甲醇進(jìn)一步稀釋，以降低磷酸甲醇的濃度，參照《中華人民共和國藥典（一部）》［3］2015 年版“血竭含量測定”項(xiàng)下的血竭素高氯酸鹽的供試品制備方法，擬定用甲醇稀釋5倍再上機(jī)進(jìn)樣。

2.2.2 提取方式的選擇 《中華人民共和國藥典（一部）》［3］2015 年版“血竭”的提取方法為“振搖 3 min”，提取時間較短，且對振搖力度和強(qiáng)度未作具體要求。同時，血竭素高氯酸鹽存在對熱不穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（加熱回流 5、15、30 min，面積積分值分別為701 170、643 005、535 080）也表明：隨著加熱回流時間的增加，血竭素高氯酸鹽的含量逐漸降低。在比較不同超聲時間對提取結(jié)果的影響，結(jié)果（超聲提取時間 5、15、30、60 min，面積積分值分別為678 550、708 970、768 535、768 940）表明：超聲 30 min和超聲60 min的結(jié)果一致，說明血竭素高氯酸鹽提取完全，考慮實(shí)驗(yàn)操作的方便性，因此選用“超聲處理（250 W，40 kHz）30 min”的提取方式。

圖1 不同比例流動相（乙腈-0.05 mol／L磷酸二氫鈉溶液）的HPLC圖

2.2.3 樣品稀釋倍數(shù)的選擇 供試品上機(jī)前的不同稀釋倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均一致，考慮稀釋倍數(shù)過大，峰面積過小，易引起較大誤差，因此選用上機(jī)前稀釋2倍的條件，即“……，取續(xù)濾液，再精密量取續(xù)濾液5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得”。

2.2.4 不同磷酸甲醇濃度對對照品的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（磷酸甲醇濃度為1%、3%、6%、9%、12%時，面積積分值分別為 535 146、531 677、537 705、538 886、537 243）表明：不同濃度的磷酸甲醇對血竭素高氯酸鹽對照品的溶劑及測定無影響，考慮不同酸度對色譜柱的影響，因此選用甲醇稀釋至刻度，即“取血竭素高氯酸鹽對照品10 mg，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，加9%磷酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，再精密量取2 mL置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得”。

2.3 理論板數(shù)的選擇 結(jié)合不同色譜柱所測得的血竭素高氯酸鹽的理論板數(shù)，以及參照《中華人民共和國藥典（一部）》［3］2015 年版中的“血竭”，相關(guān)中成藥含量測定項(xiàng)下的血竭素高氯酸鹽理論板數(shù)的規(guī)定，故理論板數(shù)按血竭素高氯酸鹽峰計算應(yīng)不低于3 000。

2.4 分析方法認(rèn)證 供試品溶液的制備：取供試品研細(xì)，每份精密稱定0.75 g，置具塞錐形瓶中，精密加入9%磷酸甲醇溶液25 mL，稱定重量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放置至室溫；再稱定重量，用9%磷酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

骨筋丸膠囊血竭陰性對照品溶液的制備：取不含血竭的陰性樣品0.75 g，余同供試品溶液的制備。

測定法：分別精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，依法測定，理論板數(shù)按血竭素高氯酸鹽計算應(yīng)不低于3 000。

2.4.1 專屬性考察 按照上述色譜條件，吸取陰性對照溶液、供試品溶液、對照品溶液，分別注入色譜儀。結(jié)果血竭陰性供試對照品溶液的色譜在血竭素高氯酸鹽對照品色譜相應(yīng)位置上無干擾，見圖2。供試品色譜主峰與相鄰峰分離度大于1.5，符合《中華人民共和國藥典（四部）》［4］2015 年版“通則 0512”的有關(guān)要求。

圖2 血竭素高氯酸鹽專屬性HPLC圖

2.4.2 線性關(guān)系的考察 參考文獻(xiàn)［5-6］，精密稱取血竭素高氯酸鹽對照品適量，用9%磷酸甲醇制成每1 mL含血竭素高氯酸鹽0.369 022 mg的對照品溶液，再用依次稀釋到以下濃度：0.184 511、0.073 804、0.036 902、0.007 380、0.003 690、0.000 738 mg／mL。精密吸取上述對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)、血竭素高氯酸鹽量（μg）為橫坐標(biāo)，在 0.007 38～3.690 22 μg 的范圍內(nèi)線性良好，得回歸方程為：Y＝1 544 1249.57X＋1 061.53，r＝0.999 9。表明在此范圍內(nèi)線性良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取已制備的對照品溶液，每次進(jìn)樣量為10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到血竭素高氯酸鹽面積的均值為369 335，RSD%為0.4，說明儀器精密度好。

2.4.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批骨筋丸膠囊樣品，按“2.4供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備6份，分別測定，每次進(jìn)樣量為10 μL，各供試品中血竭素高氯酸鹽平均含量為0.49 mg／粒，RSD%為0.6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本方法重現(xiàn)性較好，方法可行。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批骨筋丸膠囊樣品，按“2.4供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備，每次進(jìn)樣量為 10 μL，在 0～35 h 內(nèi)進(jìn)樣 10 次（0、2、4、8、12、16、 22、24、29、35），測得峰面積的 RSD%為 1.2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：供試品溶液在35 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取上述已知含量的骨筋丸膠囊9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入以下對照品溶液（每1 mL含血竭素高氯酸鹽0.016 81、0.024 65、0.030 97 mg）各25 mL，按含量測定項(xiàng)下操作，測得平均回收率為99.1%，RSD%為1.3。結(jié)果表明：骨筋丸膠囊用本法測定回收率良好。

2.4.7 不同色譜柱的考察 取同一供試品溶液，在不同廠家品牌的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱上測定，廠家分別為：資生堂（中國）投資有限公司，型號：MGII，4.6 mm×250 mm，5 μm；迪馬科技有限公司，型號：Diamonsil，4.6 mm×250 mm，5 μm；沃特世科技（上海）有限公司，型號：RP18，4.6 mm×250 mm，5 μm。 結(jié)果：分離度均良好，RSD%為 0.9，測定結(jié)果基本一致。

2.5 樣品的含量測定 取57批次骨筋丸膠囊，按擬定的含量測定方法操作，測定?？偣?3個廠家，57個批次，其中有2個廠家4個批次未檢出血竭素高氯酸鹽（占7.02%），其余53批次檢出血竭素高氯酸鹽（占 92.98%），含量在 0.02～0.69 mg／粒，其中：23批次含量在 0.02～0.08 mg／粒（占 40.35%），18批次含量在 0.11～0.19 mg／粒（占 31.58%），4批次含量在 0.20～0.28 mg／粒（占 7.02%），1批次含量為 0.38 mg／粒（占 1.75%），4批次含量在 0.40～0.49 mg／粒（占 7.02%），3 批次含量在 0.60～0.69 mg／粒（占5.26%）。含量測定結(jié)果批間差異較大，推測骨筋丸膠囊中血竭素高氯酸鹽含量受原料藥材質(zhì)量或工藝的影響大。

2.6 限度擬定 根據(jù)上述53批樣品的測定結(jié)果，血竭素高氯酸鹽的含量在 0.02～0.69 mg／粒，按《中華人民共和國藥典（一部）》［3］2015 年版“血竭含量測定”規(guī)定，血竭中血竭素高氯酸鹽的限度為1.377%。骨筋丸膠囊處方中，1 000粒骨筋丸膠囊的總投料量為913 g，其中血竭的投料量為27 g，因此每粒骨筋丸膠囊含血竭的量為29.57 mg，參考藥典規(guī)定的限度1.377%計算，每粒應(yīng)含血竭素高氯酸鹽0.40 mg。血竭是粉碎成細(xì)粉填充為膠囊劑，因此在生產(chǎn)過程中的損耗大為減少，同時考慮到保存期等不穩(wěn)定因素，以藥材含量的低限推算所訂的限度為 0.30 mg／粒。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)提取溶劑隨著磷酸濃度（1%～12%）的增加，血竭素高氯酸鹽的含量逐漸提高，且當(dāng)磷酸濃度提高至12%時，血竭素高氯酸鹽的含量不再提高。但隨著磷酸濃度的增加，血竭素高氯酸鹽的不穩(wěn)定性也隨之提高，這可能與血竭素結(jié)構(gòu)含有一個苯并吡喃環(huán)有關(guān)，這類化合物易受光熱、pH值影響，導(dǎo)致苯并吡喃環(huán)開環(huán)形成相應(yīng)的查耳酮結(jié)構(gòu)［7］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用9%磷酸甲醇濃度提取時，血竭素高氯酸鹽在35 h內(nèi)較穩(wěn)定，滿足實(shí)驗(yàn)要求。同時，考慮血竭素高氯酸鹽存在對熱不穩(wěn)定性，因此采用超聲處理方式來提取。通過本研究所擬定的血竭素高氯酸鹽定量測定方法與《中華人民共和國藥典（一部）》［3］2015 年版“血竭”的測定方法比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：所擬定的測定方法，血竭素高氯酸鹽的含量有了大幅提高。

按擬定的方法對57批骨筋丸膠囊樣品中血竭素高氯酸鹽的含量進(jìn)行測定，含量結(jié)果顯示各批間差異較大（按擬定的不得少于0.30 mg／粒的限度計算，合格率為14.06%，不合格率為85.96%），推測骨筋丸膠囊中血竭素高氯酸鹽含量受原料藥材質(zhì)量或工藝的影響大。兩個廠家4個批次未檢出血竭素高氯酸鹽，可能原因是廠家為節(jié)約成本，未使用血竭投料或者以龍血竭代替血竭投料。在血竭素高氯酸鹽含量測定中，13家生產(chǎn)企業(yè)，離散程度較大，批間差異均較大，說明企業(yè)血竭來源及工藝均不穩(wěn)定。同時，同個廠家不同批次間測定結(jié)果差異較大，提示其投料量不足，推測有可能是廠家使用劣質(zhì)血竭或減少投料量所致。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：血竭具有抗炎、止痛、抗痢疾、止瀉、止血、抗?jié)?、抗菌和抗腫瘤等多種藥理活性［8］。近年來，血竭素高氯酸鹽作為血竭藥材的主要藥理活性指標(biāo)之一［9-10］，在細(xì)胞層面上的藥理活性逐漸被發(fā)現(xiàn)，因此血竭素高氯酸鹽含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，對骨筋丸膠囊質(zhì)量控制及療效評價方面均具有重要意義。綜上所述，本研究建立的測定方法，操作簡單，實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，可有效測定骨筋丸膠囊中血竭素高氯酸鹽的含量。