李 暉 ，張澤鳳 ，2，楊 超 ，林俊芝 ，趙梓亦 ，陳昌金

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610072；3.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性肝病，包括單純性脂肪肝及脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）［1］。 目前，NAFLD 已成為慢性肝病的主要病因，西方發(fā)達(dá)國家NAFLD發(fā)病率約為20%～30%，其中20%進(jìn)展為肝硬化［2］；亞洲發(fā)病率為5%～18%，我國發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率亦達(dá)到15%左右［3］。 NAFLD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜［4-6］，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)目前對NAFLD尚無特效的治療藥物，主要采取生活方式干預(yù)、胰島素增敏劑、抗氧化劑等治療措施［7］，干預(yù)作用有限，針對不同靶點(diǎn)及多層次靶向聯(lián)合治療是進(jìn)行NAFLD干預(yù)的方向。中醫(yī)藥具有多途徑、多層次、多靶點(diǎn)綜合藥理作用的特點(diǎn)，在治療NAFLD方面具有優(yōu)勢［8］。 溫陽健脾祛痰顆粒（WYJPQT）是筆者經(jīng)驗(yàn)方，作為協(xié)定處方在臨床上應(yīng)用多年，對于NAFLD的治療取得了良好療效，且價(jià)格低廉，但需要進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

本研究在應(yīng)用HepG2細(xì)胞建立NAFLD細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，研究WYJPQT含藥血清對該細(xì)胞模型的治療作用。由于慢性炎癥在NAFLD發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，TLR4／TRIF／NF-κB 信號通路是體內(nèi)重要炎癥通路，與NAFLD的進(jìn)展具有明確的聯(lián)系，以此為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探討WYJPQT與TLR4／TRIF／NF-κB信號通路的相關(guān)性，明確其作用靶點(diǎn)，為推廣WYJPQT的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株 Wistar雄性大鼠70只，體質(zhì)量（220±20）g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)有限公司，SPF級，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（川）2015-030；在溫度（25±2）℃，12 h光照／d條件下，普通飼料，清水飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，大鼠無死亡，一般情況良好。肝癌細(xì)胞株HepG2由中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 溫陽健脾祛痰顆粒（WYJPQT）系筆者經(jīng)驗(yàn)方，作為協(xié)定處方使用多年，由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科制備為顆粒劑，主要由淫羊藿、炙黃芪、茯苓、炒白術(shù)、澤瀉、陳皮、法半夏、焦山楂、丹參等組成。制備方法：全方藥物加入8倍量水，浸泡 40 min，煎煮 3次，每次 50 min，合并 3次濾液，濃縮至相對密度1.3；加入糊精，混合，在75℃下鼓風(fēng)干燥6 h，粉碎過篩；加入80%乙醇，制粒，65℃下鼓風(fēng)干燥4 h，整粒，分包裝至10 g。陽性對照藥物多烯磷脂酰膽堿膠囊（賽諾菲北京制藥有限公司），購于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國 Gibco 公司）；油酸（Oleic acid，OA，美國MP公司）；油紅O、二甲基亞砜（美國Sigma公司）；BCA蛋白檢測試劑盒（美國Thermo公司）；三酰甘油（TG）檢測試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；異丙醇（成都科龍化工試劑廠）；4%多聚甲醛（天津市進(jìn)豐化工有限公司）；Toll樣受體 4（TLR4）上下游引物為 F：5'TTCACTTCCTCTCACCCTTT 3'，R：5'GCATCATCCTCACTGCTTC 3'；核因子 κB（NF-κB）上下游引物為F：5'TCATCCACCTTCATTCTCAAC 3'，R：5'ATCCTCCACCACATCTTCC 3'；髓樣分化因子88（MYD88）上下游引物為 F：GCTGACTTGGAGCCTG ATTC；R：GATAGGCATGTCAGGGGAGA；Toll樣白介素-1受體結(jié)構(gòu)域適配子誘導(dǎo)干擾素-b（TRIF）上下游引物為 F：CAGGAGCCTGAGGAGATGAG，R：CTG GGTAGTTGGTGCTGGTT；內(nèi)參β-actin上下游引物為 F：5'TCTCCCAAGTCCACAAGG 3'，R：5'GGGCA CGAAGGCTCATCA 3'；TLR4多克隆抗體（英國Abcam公司，ab13556）；TRIF單克隆抗體（英國Abcam公司，ab180689）；MYD88單克隆抗體（英國 Abcam公司，ab133739）；NF-κB 單克隆抗體（美國 CST 公司，#6956）；CO2培養(yǎng)箱（美國 Nuare 公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國 Applied Biosystems公司，型號：ABI 7500）；超純水儀（法國Milipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 將Wistar雄性大白鼠70只隨機(jī)分成WYJPQT高、中、低劑量組，陽性對照組及空白對照組，每組各14只。以上5組大鼠中，除空白對照組外，均予以藥物干預(yù)，其中，WYJPQT高、中、低劑量組服用 WYJPQT 生藥 8.8、4.4、2.2 g／（kg·d），將顆粒稀釋后等體積灌胃；陽性對照組予多烯磷脂酰膽堿膠囊 0.122 g／（kg·d）；每日藥量分 2 次灌胃，間隔8 h；空白對照組予生理鹽水，連續(xù)7 d。標(biāo)本采集前，所有大鼠禁食12 h；于末次給藥1 h后，采取下腔靜脈取血的方式，收集全血，4℃靜置過夜后離心，4 000 rpm×15 min，取血清，56℃ 30 min滅活，以除去可能存在的生物活性物質(zhì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，0.22 μm過濾器過濾除菌，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 NAFLD細(xì)胞模型的制備及鑒定 HepG2細(xì)胞用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，置于5%CO2孵箱中，37℃培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，待細(xì)胞匯合度為70%～80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2或1∶3傳代，將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以1×105個(gè)／孔接種于12孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后，棄掉原有培養(yǎng)液，加適量PBS緩沖液洗兩遍；模型組加入含0.25 mM OA的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以1×105個(gè)／孔接種于12孔培養(yǎng)板中，吸棄培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基，預(yù)熱的PBS洗3次，每次約5 min；用預(yù)熱的4%多聚甲醛固定30 min，棄多聚甲醛液，PBS洗2次，每次2 min；每孔加入60%異丙醇同步化液 1 mL 1～2 min，加入油紅O工作液每孔1 mL室溫下避光放置30 min；吸棄油紅O工作液，每孔加入1 mL 60%異丙醇進(jìn)行分色約30 s；每孔加入1 mL雙蒸水（ddH2O）洗3 min，每孔加入1 mL蘇木素染色3～5 min，每孔加入 1 mL ddH2O洗 3次，每次 2 min；每孔加入1 mL ddH2O液封，倒置顯微鏡下觀察，取不同倍數(shù)不同視野拍照。BCA蛋白檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白含量，按說明書操作；三酰甘油檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)三酰甘油（TG）含量，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)TG／蛋白比值。

1.2.3 含藥血清處理NAFLD的細(xì)胞模型 將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以5×104個(gè)／孔的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，待細(xì)胞匯合度為70%～80%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，NAFLD模型組給予含0.25 mM OA培養(yǎng)基造模24 h后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS清洗每孔細(xì)胞兩遍后，將NAFLD細(xì)胞模型隨機(jī)分為5組（WYJPQT高、中、低劑量組，陽性對照組，模型組），同時(shí)設(shè)置空白對照組，每組4個(gè)復(fù)孔。WYJPQT高、中、低劑量組分別加入相對應(yīng)的不同濃度10%WYJPQT含藥血清培養(yǎng)基處理48 h，陽性對照組給予10%多烯磷脂酰膽堿含藥血清培養(yǎng)基處理48 h，模型組和空白對照組則給予含10%大鼠血清培養(yǎng)基處理48 h后，分別進(jìn)行油紅O染色和細(xì)胞內(nèi)TG含量、蛋白含量測定，確定TG／蛋白比值。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測細(xì)胞中的 TLR4、TRIF、MYD88 和 NF-κB mRNA表達(dá)情況 收集細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA，mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行定量PCR檢測。設(shè)定20 μL體系，包括 cDNA 4 μL、Forward primer （F1） 0.5 μL、Reverse primer （F2） 0.5 μL、SYBR?Green PCR Master Mix 10 μL、Nuclease-Free Water 5 μL，反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 10 min；變性95℃ 15 s；退火、延伸60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為參照基因，觀察CT值的變化，測基因表達(dá)相對含量。各組基因相對表達(dá)含量計(jì)算公式：ΔCT＝目標(biāo)基因-內(nèi)參基因，ΔΔCT＝ΔCT（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCT（空白對照組），計(jì)算 2-ΔΔCT（實(shí)驗(yàn)組包括 WYJPQT 高、中、低劑量組，陽性對照組，模型組）。

1.2.5 蛋白印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞中TLR4、MYD88、TRIF、NF-κB蛋白的表達(dá)情況 RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)移至PVGF膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加一抗、二抗孵育，經(jīng)ECL發(fā)光，X線膠片曝光、顯影及定影，并以計(jì)算機(jī)圖像掃描進(jìn)行圖像分析，測定灰度值以代表蛋白的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。若各組滿足正態(tài)分布、方差齊，同一指標(biāo)間可采用單因素方差分析；組間兩兩比較，可采用LSD－t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 WYJPQT含藥血清處理NAFLD細(xì)胞模型后的油紅O染色結(jié)果 0.25 mM OA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h，油紅O染色發(fā)現(xiàn)，空白對照組細(xì)胞邊緣清晰，胞漿豐富，核膜完整，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，細(xì)胞內(nèi)未見明顯紅色脂滴；而模型組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)很多大小不等的紅色脂滴，脂肪變嚴(yán)重，部分甚至融合成片，確定NAFLD細(xì)胞模型成功建立。含藥血清處理48 h后，油紅O染色示，空白對照組細(xì)胞胞膜光滑，細(xì)胞核染成藍(lán)色，細(xì)胞內(nèi)未見明顯紅色脂滴顆粒；模型組，WYJPQT高、中、低劑量組，陽性對照組中細(xì)胞核被染成藍(lán)色，細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)紅色脂滴顆粒。與模型組相比，WYJPQT高、中、低劑量組及陽性對照組細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴顆粒略微減少；WYJPQT高、中、低劑量組與陽性對照組相比，細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴顆粒數(shù)差異不明顯，見圖1。

2.2 6組TG／蛋白比值比較 0.25 mM OA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h，檢測細(xì)胞內(nèi)TG／蛋白比值變化，與空白對照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)TG／蛋白比值明顯增高，確定NAFLD細(xì)胞模型成功建立。WYJPQT高、中、低劑量含藥血清處理48 h后，各組TG／蛋白比值見表1。

2.3 6 組 TLR4、TRIF、MYD88 和 NF-κB mRNA 相對表達(dá)水平結(jié)果 見圖2。

2.4 6組 TLR4、TRIF、MYD88和 NF-κB 的蛋白相對表達(dá)水平結(jié)果 見圖3。

圖1 6組NAFLD細(xì)胞模型的油紅O染色圖（×400）

表1 各組TG／蛋白比值比較（）

表1 各組TG／蛋白比值比較（）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與陽性對照組比較，3） P＜0.05。

TG／蛋白比值 ／（mmoL／gprot）1.17±0.24 3.18±0.291）2.46±0.292）3）2.51±0.222）3）2.19±0.252）1.97±0.222）組別空白對照組模型組高劑量組中劑量組低劑量組陽性對照組

圖2 6組TLR4、TRIF、MYD88和NF-κB mRNA相對表達(dá)水平結(jié)果圖

3 討 論

NAFLD隸屬于中醫(yī)學(xué)的“脅痛”“痰證”“瘀血”“積聚”“肥氣”“肝癖”等范疇。清代葉天士指出：“夫肌膚柔白屬氣虛，外似豐溢，里真大怯，蓋陽虛之體，惟多痰多濕……”，闡明肥胖人多為本虛標(biāo)實(shí)——?dú)馓撽柼摓楸?、多痰多濕為?biāo)。該病主要由飲食不節(jié)或體虛濕滯，導(dǎo)致肝失疏泄，脾失健運(yùn)，腎虛氣化不及，以致痰濕內(nèi)生，脂膏沉積于肝。脾虛是本病的發(fā)病基礎(chǔ)，痰濕為致病因素，本虛標(biāo)實(shí)為病機(jī)特點(diǎn)［9］。

圖3 6組TLR4、TRIF、MYD88和NF-κB的蛋白相對表達(dá)水平結(jié)果圖

WYJPQT是以“脾腎虧虛，痰濕內(nèi)蘊(yùn)”為病機(jī)學(xué)說，以“溫陽健脾，祛痰化濕”為基本治則，六君子湯合澤瀉湯加減化裁而形成。由六君子湯是在四君子湯的基礎(chǔ)上加入半夏和陳皮，補(bǔ)氣健脾，燥濕化痰；而澤瀉湯出自醫(yī)圣張仲景《金匱要略》，為治療痰飲水濕證經(jīng)典方劑。兩方合用，痰濕得除，脾得健運(yùn)，標(biāo)本兼治。WYJPQT全方配伍得當(dāng)，首重健脾益氣祛痰濕，做到“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”。脾氣旺，則痰濕生化無源。配伍淫羊藿，健脾補(bǔ)腎同時(shí)助陽化氣，陽氣盛則濁陰消，體現(xiàn)了標(biāo)本兼治的原則。

本研究選用OA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立NAFLD細(xì)胞模型。NAFLD的細(xì)胞模型目前主要是通過利用不同比例濃度的油酸、棕櫚酸、脂肪乳等來誘導(dǎo)HepG2、L02、Huh7 等細(xì)胞建立模型［10-11］。 大量的實(shí)驗(yàn)證明：HepG2細(xì)胞雖然是腫瘤細(xì)胞，但和正常肝細(xì)胞在生物學(xué)特點(diǎn)和功能上存在相似性，具備肝臟各種細(xì)胞特性，油酸、棕櫚酸等誘導(dǎo)劑都可以促使肝細(xì)胞和HepG2細(xì)胞發(fā)生脂肪變性。相比而言，HepG2細(xì)胞對脂毒性的耐受力更強(qiáng)，因此是脂肪變性細(xì)胞模型中最具優(yōu)勢和前景的備選細(xì)胞［12］。目前利用OA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立NAFLD細(xì)胞模型已屬于比較成熟的方法。本研究采取0.25 mM OA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h，采用油紅O染色后，發(fā)現(xiàn)OA誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的紅色脂滴顆粒，部分融合成片，細(xì)胞脂質(zhì)蓄積明顯；檢測細(xì)胞內(nèi)TG含量，OA誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)TG／蛋白比值明顯高于空白對照組，說明0.25 mM的OA刺激HepG2細(xì)胞24 h構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型成功。

本研究結(jié)果顯示：WYJPQT高、中、低劑量含藥血清和陽性對照組均能降低NAFLD細(xì)胞中TG／蛋白比值，從而改善NAFLD細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的狀況；WYJPQT低劑量組降低TG的作用與陽性對照組相當(dāng)。

本研究應(yīng)用OA刺激HepG2細(xì)胞，大量脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，游離的脂肪酸刺激TLR4產(chǎn)生，通過TRIF或MYD88信號通路向下傳遞激活NF-κB，使炎癥因子IL-6、TNF-α等炎癥因子大量釋放，導(dǎo)致TG的沉積，從而引起肝細(xì)胞脂肪變性、壞死［13-16］。以此為出發(fā)點(diǎn)，我們分別應(yīng)用RT-qPCR法和Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi) TLR4、TRIF、MYD88 及 NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與模型組相比，WYJPQT高、中劑量組能夠顯著下調(diào)TLR4 mRNA表達(dá)，優(yōu)于陽性對照組；高、中、低劑量組均能降低NF-κB mRNA表達(dá)量，中、低劑量組與陽性對照組作用相當(dāng)。表明WYJPQT含藥血清能夠降低NAFLD細(xì)胞模型中TG／蛋白比值，其機(jī)制之一可能與下調(diào)TLR4基因表達(dá)量，抑制NF-κB的活性有關(guān)。而Western blot法檢測結(jié)果與RT-qPCR法結(jié)果不完全一致：模型組TRIF、MYD88蛋白表達(dá)量較空白對照組明顯上調(diào)；與模型組比較，WYJPQT高、中劑量組TRIF蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，高劑量組TRIF蛋白表達(dá)量與陽性對照組相當(dāng)；WYJPQT各劑量組NF-κB相對蛋白表達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào)，而MYD88相對蛋白表達(dá)量則明顯升高。

因此，可以初步得出以下結(jié)論：WYJPQT對NAFLD細(xì)胞模型具有治療作用，降低細(xì)胞內(nèi)TG／蛋白比值，降低TRIF、NF-κB表達(dá)量；而對于TLR4的影響主要集中在mRNA水平，對蛋白表達(dá)水平影響不明顯，其原因可能跟TLR4／NF-κB信號通路在不同的細(xì)胞發(fā)揮不同的作用有關(guān)［14］；WYJPQT各劑量組MYD88的表達(dá)水平呈現(xiàn)升高態(tài)勢，因此WYJPQT主要通過調(diào)控TLR4／TRIF／NF-κB信號通路達(dá)到對NAFLD細(xì)胞模型的治療作用，對MYD88的表達(dá)影響則需要深入進(jìn)行驗(yàn)證。

NAFLD發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，本研究僅對其中TLR4／TRIF／NF-κB信號通路進(jìn)行了初步探討。后續(xù)研究考慮在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕向?yàn)證WYJPQT的療效，深入探討其作用機(jī)制，為臨床上應(yīng)用WYJPQT治療NAFLD提供可靠依據(jù)。