國(guó) 強(qiáng) 白雪峰 周勇慧

胃癌始終是危害我國(guó)居民身心健康的常見(jiàn)惡性腫瘤。目前，普外科手術(shù)是治療早期胃癌的重要手段，但其難以控制殘留的癌細(xì)胞局部再生長(zhǎng)，且臨床中多數(shù)患者確診時(shí)已為進(jìn)展期胃癌，接受普外科手術(shù)治療同時(shí)往往需輔以化療、放療等其他綜合性治療手段，尤其是化療已經(jīng)成為多數(shù)進(jìn)展期胃癌患者治療必不可少的環(huán)節(jié)[1]。作為新型的第三代鉑類(lèi)化療藥物，近年來(lái)奧沙利鉑治療進(jìn)展期胃癌的良好效果已取得廣泛關(guān)注，但腫瘤多藥耐藥性的存在成為了阻礙奧沙利鉑化療效果的重要因素[2]。迄今為止，胃癌的多藥耐藥性機(jī)制尚未完全明確。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，既往研究[3-4]發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)血管生成，影響多種腫瘤的病理特征，也與耐藥形成有關(guān)。因此，明確胃癌組織survivin基因表達(dá)與奧沙利鉑耐藥性的關(guān)系對(duì)預(yù)測(cè)患者化療效果有重要意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

原發(fā)性胃癌標(biāo)本來(lái)源于2016年6月至2018年3月經(jīng)包頭市腫瘤醫(yī)院病理確診且行普外科手術(shù)切除的80例胃癌患者，其中有36例取得距離癌組織邊界>3 cm的癌旁組織標(biāo)本(術(shù)后證實(shí)無(wú)腫瘤細(xì)胞存在)；所有標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，然后經(jīng)蘇木精-伊紅染色進(jìn)行病理診斷。所有患者的病理標(biāo)本檢查明確診斷為腺癌，并符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部制定的《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 316-2010)》[5]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)前未接受任何身體耐受相關(guān)藥物化療，未合并其他惡性腫瘤，臨床各項(xiàng)資料完善。80例中，男性51例(63.75%)，女性29例(36.25%)，年齡36～69歲，平均(54.08±10.14)歲，其中賁門(mén)癌、胃體癌、胃竇癌分別為35例、35例、10例。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器、藥物及試劑 封片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)波德BIRD公司；顯微鏡購(gòu)自日本NIKON公司。奧沙利鉑購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；Survivin兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Zymed公司；SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒、加強(qiáng)型二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.2.2 免疫組化染色及結(jié)果判定 采用免疫組化染色SP法。用磷酸鹽緩沖洗液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性胃癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照，采用兩步法進(jìn)行，依次加一抗、加二抗進(jìn)行孵化，最后以DAB顯色，蘇木精復(fù)染，進(jìn)行相應(yīng)處理后封片，于10×40倍光鏡下觀察10個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞較多的視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。免疫組化染色陽(yáng)性反應(yīng)為明顯高于背景染色的黃-棕色顆粒，由高年資病理科醫(yī)師以雙盲法進(jìn)行判斷。以半定量積分方法記錄survivin基因表達(dá)結(jié)果，根據(jù)免疫組化染色反應(yīng)的深度及染色陽(yáng)性細(xì)胞占觀察的腫瘤細(xì)胞的百分比計(jì)分，兩項(xiàng)指標(biāo)分值的乘積分為4級(jí)：0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.2.3 腫瘤細(xì)胞懸液制備及MTT藥物敏感試驗(yàn) 取瘤體無(wú)壞死部位置于Hanks液無(wú)菌小瓶，PBS反復(fù)沖洗后剪成糊狀，銅網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min離心5 min，去上清，Hanks液漂洗，10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，以0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液計(jì)數(shù)，調(diào)整單細(xì)胞懸液至活細(xì)胞濃度3×105/ml。取單細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，每孔180 μl。用藥組加入藥物終濃度為10倍血漿峰值濃度的奧沙利鉑，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；對(duì)照組不加藥物；空白組無(wú)培養(yǎng)細(xì)胞。置CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)48 h，各孔加入5 mg/ml的噻唑藍(lán)(MTT)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。以酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(A)值。取3孔A值的平均值作為最終A值。腫瘤細(xì)胞抑制率=(對(duì)照組A值-用藥組平均A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。判定標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞抑制率<30%為耐藥，30%～50%、>50%分別為中度敏感、高度敏感。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0分析和處理研究數(shù)據(jù)，其中survivin基因表達(dá)情況、原發(fā)性胃癌的病理特征、奧沙利鉑的耐藥性等計(jì)數(shù)資料采取率(%)表示，組間對(duì)比進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，原發(fā)性胃癌survivin基因表達(dá)與奧沙利鉑耐藥性的關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 survivin基因表達(dá)情況

Survivin陽(yáng)性著色位于細(xì)胞質(zhì)(多見(jiàn)于胞質(zhì))。原發(fā)性胃癌標(biāo)本中，survivin基因陽(yáng)性表達(dá)率為68.75%，癌旁組織標(biāo)本陽(yáng)性表達(dá)率為11.11%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=33.003，P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 原發(fā)性胃癌、癌旁組織標(biāo)本中survivin基因表達(dá)情況(例，%)

2.2 survivin基因表達(dá)與原發(fā)性胃癌病理特征的關(guān)系

Ⅲ～Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性胃癌患者癌組織survivin基因陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同性別、年齡、解剖位置的患者癌組織survivin基因表達(dá)情況比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 survivin基因表達(dá)與胃癌病理特征的關(guān)系(例，%)

2.3 原發(fā)性胃癌survivin基因表達(dá)與奧沙利鉑耐藥性的關(guān)系

本組80例原發(fā)性胃癌組織對(duì)奧沙利鉑耐藥者22例，達(dá)27.50%；隨著survivin基因表達(dá)強(qiáng)度的增強(qiáng)，奧沙利鉑耐藥率逐漸增高，敏感性逐漸下降，差異經(jīng)秩和檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=12.051，P<0.05)；Spearman相關(guān)性分析顯示原發(fā)性胃癌survivin基因表達(dá)與奧沙利鉑耐藥率呈正相關(guān)(γ=0.447，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 原發(fā)性胃癌survivin基因表達(dá)與奧沙利鉑耐藥性的關(guān)系/例

3 討論

作為凋亡抑制蛋白家族中1個(gè)結(jié)構(gòu)獨(dú)特的新成員，survivin具有抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。已有大量文獻(xiàn)[6-8]證實(shí)survivin基因在多種惡性腫瘤細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，如肺癌、卵巢癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌等，具有腫瘤特異性表達(dá)的特點(diǎn)。有報(bào)道[9]發(fā)現(xiàn)survivin是G2/M期的調(diào)節(jié)基因，其表達(dá)水平與細(xì)胞周期密切相關(guān)，繼而可參與細(xì)胞周期調(diào)控、有絲分裂及腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。潘存?zhèn)サ萚10]的報(bào)道顯示，survivin基因表達(dá)與腫瘤分化程度、胃癌局部浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，并與微血管密度(MVD)具有明顯的相關(guān)性，由此認(rèn)為的過(guò)度表達(dá)是胃癌發(fā)生過(guò)程中的早期事件，并證實(shí)survivin基因能夠促進(jìn)胃癌血管形成。本研究結(jié)果顯示，Survivin陽(yáng)性著色位于細(xì)胞質(zhì)，原發(fā)性胃癌標(biāo)本中survivin基因陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率(68.75% vs 11.11%)；且Ⅲ～Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性胃癌患者癌組織survivin基因陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。以進(jìn)一步表明胃癌組織中survivin基因表達(dá)水平高，且可反映其病理特征，與上述報(bào)道具有一致性。

更值得關(guān)注的是，本組80例原發(fā)性胃癌標(biāo)本對(duì)奧沙利鉑耐藥者22例，達(dá)27.50%，隨著survivin基因表達(dá)強(qiáng)度的增加，奧沙利鉑耐藥率逐漸增加，敏感性逐漸下降。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果證實(shí)原發(fā)性胃癌survivin基因表達(dá)與奧沙利鉑耐藥率呈正相關(guān)，即胃癌組織中survivin基因表達(dá)與奧沙利鉑耐藥性密切相關(guān)。謝麗等[11]在關(guān)于胃癌藥物敏感度的研究中發(fā)現(xiàn)Survivin mRNA表達(dá)用于判斷奧沙利鉑敏感度的準(zhǔn)確率為70%，與本文觀點(diǎn)類(lèi)似。目前，腫瘤多藥耐藥的作用機(jī)制非常復(fù)雜，臨床已明確的可能機(jī)制主要包括[12-13]：①細(xì)胞微環(huán)境發(fā)生改變；②膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物外排及改變細(xì)胞內(nèi)藥物濃度；③拓?fù)洚悩?gòu)酶II等相關(guān)解毒酶的表達(dá)異常；④細(xì)胞凋亡途徑與增殖分化異常。survivin基因?yàn)槟壳盀橹挂阎囊种萍?xì)胞凋亡能力最強(qiáng)的因子，我們認(rèn)為，survivin基因影響奧沙利鉑耐藥性的原因與其抑制細(xì)胞凋亡能力密切相關(guān)，由于其能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，繼而可促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂和加快新生血管生成，繼而參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。周露婷等[14]前期報(bào)道對(duì)survivin基因影響胃癌細(xì)胞耐藥性有不同的解釋?zhuān)磗urvivin表達(dá)高的癌細(xì)胞對(duì)某些化療藥物不敏感，或者化療本身誘發(fā)了survivin的表達(dá)，繼而增加了腫瘤細(xì)胞的生存力。賈楠等[15]則與本文持類(lèi)似一致，認(rèn)為survivin屬于腫瘤特異性凋亡抑制因子，可通過(guò)增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的凋亡抵抗能力而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥。造成這種差異的原因可能為不同研究探討的化療藥物不同或患者存在個(gè)體化差異，可見(jiàn)survivin基因?qū)Π▕W沙利鉑在內(nèi)的化療藥物耐藥性的影響尚需進(jìn)一步探討。

綜上，胃癌組織survivin基因表達(dá)與奧沙利鉑耐藥性相關(guān)，抑制survivin基因表達(dá)有可能逆轉(zhuǎn)化療抵抗，有望為提高胃癌化療療效提供新的方向。