盛建軍，李 想，張彥雪，何永美，謝春梅，祖艷群，李 元

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明650201）

20 世紀(jì)末期，由于生產(chǎn)生活中大量排放氟氯烴類化合物，平流層臭氧層開始變得稀薄，導(dǎo)致了到達(dá)地表的紫外線強(qiáng)度增加[1]。近年來，得益于《蒙特利爾條約》的簽訂，氟氯烴類化合物被限制使用，臭氧層衰減速度減慢[1]。但部分地區(qū)地表UV-B 輻射仍在增強(qiáng)[2]。地表UV-B 輻射增強(qiáng)會(huì)影響植物的生長發(fā)育、生理代謝和紫外吸收物質(zhì)[3]。植物通過增加黃酮類物質(zhì)含量抵御UV-B 輻射侵害[4]。研究表明UV-B 輻射對植物的生長效應(yīng)具有雙重性，低強(qiáng)度的UV-B 輻射可以作為調(diào)控因子，超過植物耐受度則表現(xiàn)為脅迫因子[5]。適量補(bǔ)充UV-B 輻射，可以作為信號調(diào)節(jié)因子，通過高等植物的UV-B 受體（UV resistance locus 8，UVR8）激活體內(nèi)修復(fù)機(jī)制[6]。

原花青素是一種紫外吸收物質(zhì)，主要由黃酮-3-醇單元（兒茶素、表兒茶素及其3-O-沒食子酸酯和表沒食子酸酯）組成的聚合酚類化合物[7]。類黃酮代謝途徑可以生產(chǎn)黃酮醇、花青素和原花青素[8]。目前研究主要集中在UV-B 輻射對花青素[9]和總黃酮[10]的影響，關(guān)于UV-B 輻射對原花青素影響的研究較少。原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化活性和自由基清除功能，能夠防治因自由基引起的心血管疾病[11]、糖尿病[12]、阿爾茲海默癥[13]、炎癥[14]等疾病。被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、藥品和化妝品等領(lǐng)域，是極具市場開發(fā)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的天然產(chǎn)物，近年來，原花青素已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。已有研究表明UV-B 輻射可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)的原花青素合成，并且原花青素在植物器官和組織中的含量呈動(dòng)態(tài)變化[15]，已有研究表明原花青素在葡萄中主要分布在果皮和種子中[16]。但是不同UV-B 輻射強(qiáng)度下植物體內(nèi)的原花青素含量的變化特征、植物體內(nèi)原花青素的分布特征鮮有報(bào)道。

稻米是我國傳統(tǒng)主食之一，目前中國的水稻種質(zhì)資源中，有10%左右屬于有色稻，其中紅米稻種質(zhì)有8963 份，占有色稻的首位[17]。紅米中富含大量花青素、原花青素等生物活性物質(zhì)[18]，目前，大多數(shù)的研究都關(guān)注與藍(lán)莓[19]、葡萄[20]等水果中的原花青素含量，對水稻中原花青素的研究較少。為了明確地表UVB 輻射增強(qiáng)對水稻的生長發(fā)育和原花青素含量與分布的影響，本研究以元陽梯田傳統(tǒng)稻種“白腳老粳”為材料，通過原位種植模式下增加不同強(qiáng)度的UV-B 輻射，研究不同UV-B 輻射強(qiáng)度對紅米生長和籽粒中原花青素含量和分布的變化特征，為研究UV-B 輻射對籽粒中原花青素含量和分布的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于云南省紅河州元陽縣新街鎮(zhèn)箐口村（23°07′N、102°44′E），該地區(qū)海拔高度為1600 m，UV-B 輻射背景強(qiáng)度為10 kJ·m-2·d-1。當(dāng)?shù)赝寥罏樗藶橥?，土壤pH 值為6.45，有機(jī)質(zhì)含量為26.8 g·kg-1，全N 為2.48 g·kg-1，全P 為0.74 g·kg-1，全K 為6.03 g·kg-1，堿解N 為67.9 mg·kg-1，速效P 為20.5 mg·kg-1，速效K 為150.7 mg·kg-1。種植的水稻品種為白腳老粳，種子由云南省紅河州元陽縣新街鎮(zhèn)農(nóng)科站提供，白腳老粳在當(dāng)?shù)匾延?00 多年的種植歷史，是目前主要的培育品種之一。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

水稻種植處理：白腳老粳于2017 年3 月20 日播種育苗，5月15日移栽至試驗(yàn)小區(qū)。試驗(yàn)點(diǎn)共布置12個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為390 cm×225 cm，小區(qū)間隔50 cm，每個(gè)小區(qū)種植10 行水稻，每行10 株，行距30 cm，株距15 cm，每叢為一株秧苗，外圍設(shè)置保護(hù)行（2行3 列）。在水稻生長期內(nèi)不使用任何化肥和農(nóng)藥，整個(gè)生育期處于淹水狀態(tài)。

UV-B 輻射處理：每行水稻上方安裝一個(gè)可調(diào)節(jié)長度的燈架，架設(shè)UV-B 燈管（40 W，波長280～320 nm，上海顧村儀器廠提供），用UV-B 輻射測定儀（北京師范大學(xué)光電儀器廠提供）測定水稻植株頂端輻射強(qiáng)度。設(shè)自然光（0 kJ·m-2·d-1）和UV-B 輻射（2.5、5.0、7.5 kJ·m-2·d-1）4 組處理，分別相當(dāng)于當(dāng)?shù)?%、10%、20%、30%的臭氧衰減。每日輻照時(shí)間為7 h（10：00—17：00），陰天或雨天不進(jìn)行UV-B 輻射處理。隨著水稻的生長調(diào)節(jié)燈架高度，保持輻射強(qiáng)度不變。6 月25 日水稻抽穗期開始照燈，9 月28 日收獲水稻后停止試驗(yàn)。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 生長指標(biāo)

9月28日水稻收獲后，對水稻千粒質(zhì)量、生物量、產(chǎn)量、粒長、粒寬、籽粒長寬比進(jìn)行測量。每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取10 株水稻測定千粒質(zhì)量、生物量、粒長、粒寬并計(jì)算長寬比，測量方式為常規(guī)測量。籽粒收獲后經(jīng)自然風(fēng)干再測定產(chǎn)量。

每株籽粒生物量的測定：待收獲時(shí)，用自來水將水稻籽粒輕輕的沖洗干凈，然后在通風(fēng)且無陽光直射的室內(nèi)自然風(fēng)干。裝入牛皮紙袋內(nèi)，放入烘箱在80 ℃烘至恒質(zhì)量。烘干時(shí)，每隔24 h 測定一次直到質(zhì)量恒定，迅速稱量烘干后的籽粒質(zhì)量。

1.3.2 原花青素含量的測定

參照劉連新等[21]的方法，用高效液相色譜法（HPLC）測定原花青素含量。色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙腈=75∶5∶20；流速：1.0 mL·min-1；紫外檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：室溫。

對照品溶液的制備：精密稱取原花青素對照品0.002 5 g，置于25 mL 容量瓶中，先用部分甲醇溶解，超聲10 min，定容，超聲，用0.25 μm微孔濾膜過濾，得100 μg·mL-1的對照品貯備溶液。

樣品溶液的配制：將白腳老粳的稻殼和糙米分離，分別取稻殼和糙米樣品1.500 0 g，切碎，加入不低于80%的甲醇15 mL，加入磷酸調(diào)節(jié)pH=3.5，溫度控制在80 ℃，微波提取45 min。過濾提取液體，取上清液0.5 mL，用甲醇稀釋到50 mL。樣品用0.25 μm的微孔濾膜過濾，得待測樣品溶液，裝入樣品瓶中，備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密移取對照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00 mL，分別置于5 mL 的棕色容量瓶中用甲醇稀釋，超聲，定容，用0.25 μm 微孔濾膜過濾，注入樣品瓶。按照上述液相方法測定，記錄峰面積。以對照品進(jìn)樣濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 紅米籽粒石蠟切片的制作

參照康海岐等[22]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)，具體操作步驟如下：

取水稻籽粒分別進(jìn)行橫切（垂直于芒和小穗軸連線切開）和縱切（水平于芒和小穗軸連線切開），切成數(shù)段后依次放入5%、10%、20%、30%、50%、70%的酒精中各5 min，最后將材料放入FAA 固定液中（每100 mL 含38%甲醇5 mL、冰醋酸5 mL、70%酒精90 mL）中保存。將固定好的材料依次用70%、80%、90%、95%的酒精脫水30 min，最后用純酒精脫水2 h（重復(fù)3次）。取脫水后的材料，依次放入1∶2、1∶1、2∶1的二甲苯∶酒精中各浸泡3 h，然后轉(zhuǎn)入純二甲苯中浸泡6 h（重復(fù)2 次）。從二甲苯中取出材料，放入融化的石蠟（60 ℃）中恒溫浸蠟2 h（重復(fù)3 次），必須保持恒溫，并且溫度不能過高。浸蠟后，將材料封入蠟塊中。將包埋的材料經(jīng)過修整后，使用專用切片機(jī)（LEICA RM 2016）切成厚度為3 μm 的連續(xù)切片。在切片過程中，向材料中心處噴少量水，快速切片可以防止中心淀粉部分脫落，將切片放入水中，然后用載玻片撈取。將有材料的載玻片放入純二甲苯中30 min（重復(fù)3 次），然后依次在100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、30%、0 的酒精中清洗15 min。放入脫色劑（乙醇∶冰乙酸=3∶1）中脫色，再放入0.1% 4-（二甲基氨基）肉桂醛（DMACA）染劑中染色，后依次放入0、30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%酒精中清洗15 min。DMACA 染劑（0.1%）的配制：稱取0.05 g DMACA 加入50 mL 的酸化乙醇中（現(xiàn)配）。酸化乙醇：將36%濃鹽酸（12.5 mL）、12.5 mL蒸餾水和75 mL乙醇（91%）混合，18～25 ℃中保存。粘片：取出染色后的撥片，立即用中性樹膠封固成永久切片，然后放入40 ℃烘箱中烘48 h。觀察：在光學(xué)顯微鏡下觀察（YS100，Nikon Japan），并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，計(jì)算平均值和方差。使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20 通過單因素差異分析，采用Duncan 檢驗(yàn)法，P＜0.05水平進(jìn)行處理間的差異性分析。用Origin 9.1作圖。

圖1 不同UV-B輻射對水稻稻殼中原花青素含量的影響Figure 1 Effect of different UV-B radiations on proanthocyanidins content in husk of rice

圖2 不同UV-B輻射對水稻糙米中原花青素含量的影響Figure 2 Effects of different UV-B radiations on proanthocyanidins content in brown of rice

表1 不同UV-B輻射強(qiáng)度對白腳老粳生長的影響Table 1 Effect of different UV-B radiation intensities on the growth of the“baijiaolaojing”

2 結(jié)果與分析

2.1 不同UV-B強(qiáng)度對白腳老粳籽粒形態(tài)的影響

UV-B 輻射會(huì)影響白腳老粳籽粒形態(tài)（表1）。隨著UV-B 輻射強(qiáng)度的增加，白腳老粳的粒長、粒寬、千粒質(zhì)量、籽粒生物量和產(chǎn)量，都出現(xiàn)不同程度的下降。UV-B 輻射增強(qiáng)使籽粒粒長顯著降低。不同UV-B 輻射間差異沒有達(dá)到顯著水平，在7.5 kJ·m-2·d-1時(shí)粒長降幅達(dá)到了最大11.6%。UV-B 輻射為2.5 kJ·m-2·d-1和5.0 kJ·m-2·d-1時(shí)白腳老粳的粒寬無顯著變化，當(dāng)UV-B 輻射強(qiáng)度增加到7.5 kJ·m-2·d-1時(shí)，粒寬顯著降低了7.8%。在不同UV-B 輻射處理下，只有2.5 kJ·m-2·d-1時(shí)籽粒長寬比與自然光照下存在顯著差異，降幅為8.7%。千粒質(zhì)量和每株籽粒生物量隨著UV-B輻射增強(qiáng)持續(xù)降低，當(dāng)UV-B 輻射增加到2.5 kJ·m-2·d-1時(shí)千粒質(zhì)量和每株籽粒生物量顯著降低，伴隨著UV-B 輻射強(qiáng)度增加，抑制效應(yīng)更加明顯，當(dāng)UV-B 輻射強(qiáng)度增加到7.5 kJ·m-2·d-1時(shí)，千粒質(zhì)量降低36.1%，每株籽粒生物量下降44.5%。UV-B 輻射增強(qiáng)，水稻產(chǎn)量顯著降低，但是不同UV-B 輻射間差異沒有達(dá)到顯著水平，在7.5 kJ·m-2·d-1時(shí)產(chǎn)量降幅達(dá)到最大22.8%。

2.2 不同UV-B強(qiáng)度對紅米原花青素含量的影響

白腳老粳稻殼和糙米中原花青素含量隨著UVB 輻射強(qiáng)度變化而變化。如圖1 所示，稻殼中原花青素含量隨著UV-B 輻射增加先增后減，在5.0 kJ·m-2·d-1時(shí)稻殼中原花青素含量達(dá)到最大值4.06 μg·g-1，相對于自然光照下增加了124.7%。隨著UV-B 輻射強(qiáng)度的繼續(xù)增加，當(dāng)輻射強(qiáng)度達(dá)到7.5 kJ·m-2·d-1時(shí)，稻殼中原花青素含量顯著降低，稻殼中原花青素含量與自然光相比無顯著差異，比7.5 kJ·m-2·d-1顯著降低了45.9%。這說明UV-B 輻射對水稻稻殼中原花青素含量有著低強(qiáng)度促進(jìn)，高強(qiáng)度抑制的效果。如圖2 所示，糙米中原花青素含量在2.5 kJ·m-2·d-1與5.0 kJ·m-2·d-1UV-B 輻射強(qiáng)度下無顯著變化，當(dāng)UV-B 輻射強(qiáng)度增加到7.5 kJ·m-2·d-1時(shí)，糙米中原花青素含量顯著降低，降幅為37.9%。低強(qiáng)度UV-B輻射（2.5 kJ·m-2·d-1和5.0 kJ·m-2·d-1）對糙米中原花青素含量無影響，但是高UV-B輻射（7.5 kJ·m-2·d-1）下糙米中原花青素含量顯著降低。

2.3 不同UV-B強(qiáng)度對紅米原花青素分布的影響

水稻籽粒中的原花青素分布如圖3 所示，原花青素主要聚集在果皮中以及胚乳周邊；越靠近中心區(qū)域，原花青素分布越少。不同強(qiáng)度UV-B 輻射下，籽粒中原花青素分布都呈現(xiàn)由外到內(nèi)，逐漸減少的規(guī)律。但是，UV-B 輻射對原花青素的面積占比有顯著影響（圖4）。對水稻籽粒進(jìn)行橫切后發(fā)現(xiàn)，UV-B 輻射在水平層面上會(huì)促進(jìn)原花青素的分布，在2.5 kJ·m-2·d-1UV-B 輻射強(qiáng)度下，原花青素面積占比都顯著上升，增幅為39.5%，占比達(dá)到31.8%。但是對籽粒進(jìn)行縱切后發(fā)現(xiàn)，UV-B 輻射在垂直層面上會(huì)抑制原花青素的分布，在5.0 kJ·m-2·d-1和7.5 kJ·m-2·d-1的條件下，原花青素面積占比都顯著降低，降幅分別為24%和32.5%。自然光照下，原花青素占比最大，達(dá)到了22.8%，7.5 kJ·m-2·d-1時(shí)籽粒原花青素占比最小，僅有15.4%。不同UV-B 輻射強(qiáng)度處理下，原花青素在水平層面占比全部顯著大于垂直層面占比。

圖3 水稻籽粒中原花青素分布示意圖Figure 3 Schematic diagram of proanthocyanidins distribution in rice grains

圖4 不同UV-B輻射下水稻籽粒中原花青素分布Figure 4 Schematic diagram of proanthocyanidins distribution in rice grains

3 討論

UV-B 輻射作為非生物因子對水稻籽粒形態(tài)和原花青素含量有顯著影響。水稻籽粒形態(tài)是受多基因、多途徑調(diào)控的復(fù)雜形狀[23]。本研究發(fā)現(xiàn)UV-B 輻射會(huì)影響籽粒的粒長、粒寬和粒質(zhì)量。UV-B 輻射對水稻籽粒形態(tài)的影響機(jī)理尚不明確。UV-B 輻射可以影響基因的表達(dá)，高等植物的UV-B 受體UVR8 可以感知到UV-B 信號[24]，在植物沒有受到UV-B 照射時(shí)，UVR8 在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中以二聚體的形式存在，在接受到UV-B 信號后，UVR8從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與組成型光形態(tài)建成1（Constitutively photomorphogenic 1，COP1）蛋白發(fā)生作用，開啟UV-B 信號通道，引起下游應(yīng)答和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[25-26]，從而影響籽粒形態(tài)。也可能是增強(qiáng)UV-B 輻射使植物體內(nèi)發(fā)生強(qiáng)烈的自由基反應(yīng)，產(chǎn)生大量的自由基，傷害植物光系統(tǒng)Ⅱ，使凈光合速率降低，同時(shí)脫落酸（ABA）的含量升高，可抑制光合作用，引起植株光合能力下降，降低生物量[27]，從而影響籽粒形態(tài)。

UV-B 輻射能導(dǎo)致作物植株有效穗數(shù)、穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒質(zhì)量下降，最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降[28]。農(nóng)作物產(chǎn)量是評估臭氧衰減影響的關(guān)鍵指標(biāo)，UV-B 輻射改變了作物群體的形態(tài)特征和產(chǎn)量的形成過程，最終導(dǎo)致產(chǎn)量降低。在大田或溫室條件下，增強(qiáng)UV-B輻射都會(huì)影響作物的產(chǎn)量，大多數(shù)研究結(jié)果是增強(qiáng)UV-B 輻射使作物產(chǎn)量降低[29]，但也有報(bào)道表明增強(qiáng)UV-B 輻射對作物產(chǎn)量沒有影響或使作物產(chǎn)量顯著增高[30]。本試驗(yàn)中，增強(qiáng)UV-B 輻射使得白腳老粳水稻產(chǎn)量降低，符合大多數(shù)研究結(jié)果，說明水稻在抵御外界脅迫、提高自身抗性的同時(shí)，消耗了生長所需的能量和水稻發(fā)育早期階段用于合成蛋白質(zhì)的光合產(chǎn)物[29]，最終導(dǎo)致水稻產(chǎn)量下降。

環(huán)境因素會(huì)誘導(dǎo)植物中原花青素合成，過高或過低的條件都達(dá)不到誘導(dǎo)作用[31]。本研究中，在5.0 kJ·m-2·d-1UV-B 輻射增強(qiáng)效果下，稻殼中原花青素含量顯著增加，而糙米中原花青素含量無顯著變化，稻殼作為稻米外層覆蓋物可以保護(hù)內(nèi)部不受外界生物作用和非生物作用[32]，當(dāng)UV-B 輻射增加到7.5 kJ·m-2·d-1時(shí)，稻殼和糙米中原花青素含量都顯著降低。這可能是UV-B 輻射強(qiáng)度過大，超過了稻殼耐性范圍，稻殼失去了保護(hù)能力，所以稻殼和糙米中原花青素都顯著降低。在一定溫度范圍（10～15 ℃）內(nèi)，溫差越大，溫度越低，黑果枸杞中原花青素含量就越大[33]。溫度超過這個(gè)范圍后，原花青素含量顯著降低。異常溫度和UV-B 輻射都屬于逆境，植物在逆境中會(huì)促進(jìn)原花青素合成，超過耐性范圍后，原花青素含量開始下降。原花青素代謝途徑的關(guān)鍵酶之一是黃烷酮-3-羥化酶（Flavanone3-hydroxylase，F(xiàn)3H），處于類黃酮生物合成途徑中的分叉點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，荒漠植物紅砂在增強(qiáng)的UV-B 輻射脅迫下類黃酮代謝途徑的關(guān)鍵酶F3H的活性先顯著升高后顯著降低，但仍顯著高于處理前水平。這表明UV-B 輻射誘導(dǎo)了類黃酮生物合成途徑中酶活性的增強(qiáng)，合成大量的類黃酮物質(zhì)，參與抗氧化反應(yīng)，提高植物在UV-B 輻射脅迫下的自我保護(hù)能力[34]。UV-B輻射可能誘導(dǎo)了白腳老粳稻殼中F3H 酶、抗氧化酶活性的增強(qiáng)，稻殼中合成大量的原花青素，參與抗氧化反應(yīng)。耿艷艷等[35]研究表明黑米中原花青素二聚體等物質(zhì)的含量與其抗氧化活性高度相關(guān)，保護(hù)穎果，提高了水稻UV-B 輻射脅迫下的自我保護(hù)能力。

原花青素在植物果實(shí)中的分布存在顯著差異，芒果果皮中原花青素含量顯著高于果肉中原花青素含量[36]。山葡萄果皮中原花青素含量隨著果實(shí)成熟含量顯著增加，而種子中原花青素含量隨著果實(shí)成熟無顯著變化[37]。本研究發(fā)現(xiàn)水稻籽粒原花青素主要分布在皮層和胚乳表層，也有研究表明有色稻的花青素主要沉積在果皮細(xì)胞中，但是在胚乳中未發(fā)現(xiàn)花青素沉積[38]，而李鳳英等[39]研究發(fā)現(xiàn)原花青素普遍存在于植物的皮、殼、核中。UV-B 輻射增強(qiáng)對籽粒原花青素垂直分布和水平分布的影響應(yīng)該與籽粒不同部位接受UV-B輻射不均勻有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

UV-B 輻射增強(qiáng)會(huì)抑制水稻生長，對水稻籽實(shí)的粒長、粒寬、千粒質(zhì)量、籽粒生物量和產(chǎn)量有顯著影響。稻殼中原花青素含量在不同UV-B 輻射下呈現(xiàn)單峰曲線；當(dāng)UV-B 輻射達(dá)到7.5 kJ·m-2·d-1時(shí)，對糙米中原花青素含量有顯著降低作用。原花青素在水稻籽粒中呈現(xiàn)由外到內(nèi)逐漸減少的規(guī)律，原花青素主要聚集在果皮和胚乳表層。UV-B 輻射對水稻籽實(shí)中原花青素分布有顯著影響，在垂直結(jié)構(gòu)上，UV-B輻射增強(qiáng)會(huì)抑制原花青素面積占比，在水平結(jié)構(gòu)上，UV-B 輻射增強(qiáng)會(huì)促進(jìn)原花青素面積占比。稻殼中原花青素含量隨UV-B 輻射呈拋物線關(guān)系，在增加5.0 kJ·m-2·d-1UV-B 輻射處理下稻殼中原花青素含量達(dá)到最大4.06 μg·g-1，隨后降低。糙米中原花青素含量在低強(qiáng)度UV-B 輻射處理下無顯著變化，在7.5 kJ·m-2·d-1時(shí)顯著降低。