王鳳英 ，肖乾鵬，王 星

（1.廣州安芮潔環(huán)保科技有限公司，廣東 廣州 510450；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

【研究意義】黑水虻Hermetia illucensL.隸屬雙翅目Diptera水虻科Stratiomyidae扁角水虻屬Hermetia，又名亮斑扁角水虻?？赏ㄟ^(guò)取食有機(jī)廢棄物產(chǎn)出新型動(dòng)物飼料及有機(jī)肥，是當(dāng)前研究較多的一種資源昆蟲[1-5]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)黑水虻幼蟲和成蟲的生物學(xué)特性進(jìn)行了較多研究[6-8]，但關(guān)于冷藏黑水虻蟲卵的報(bào)道甚少?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Holmes等對(duì)蟲卵孵化的發(fā)育起始溫度進(jìn)行研究，認(rèn)為黑水虻卵發(fā)育的起始溫度在 12～16 ℃[9]。Shaphan等在研究溫度和飲食對(duì)黑水虻生長(zhǎng)發(fā)育的影響中發(fā)現(xiàn)：10 ℃時(shí)，蟲卵無(wú)法孵化；15 ℃冷藏14 d，蟲卵孵化率為10.6%（±2.1）%；20 ℃冷藏8 d，孵化率為59%（±10.6）%，冷藏效果不理想[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】我們認(rèn)為蟲卵冷藏后無(wú)法順利孵化的原因有以下幾點(diǎn)：一是冷藏溫度低于蟲卵發(fā)育起始溫度，同時(shí)未采用正確手段使蟲卵休眠或滯育，蟲卵死亡；二是冷藏過(guò)程中濕度不適宜，低溫環(huán)境中，空氣中水分低，蟲卵易脫水死亡，而濕度過(guò)高時(shí)，水汽在蟲卵表面凝結(jié)，蟲卵死亡；三是蟲卵儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在冷藏過(guò)程中消耗過(guò)快，無(wú)法支撐蟲卵正常孵化；四是基于Mazur提出低溫對(duì)卵的傷害隨卵的發(fā)育而減輕的觀點(diǎn)[11]，推測(cè)不同發(fā)育階段的蟲卵對(duì)低溫的耐受性不同?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】綜合以上4點(diǎn)考慮，為提高冷藏蟲卵的孵化率，本試驗(yàn)將黑水虻卵發(fā)育劃分為卵裂期、胚盤胚帶形成期、原腸形成期、胚體分節(jié)期、破殼期（因體壁形成期與器官形成期發(fā)育時(shí)間交叉，故本研究統(tǒng)一為破殼期）5個(gè)時(shí)期，并將5個(gè)發(fā)育時(shí)期的蟲卵分別在溫度為12 ℃、濕度為80%環(huán)境中進(jìn)行冷藏。姬越等研究了黑水虻發(fā)育的適宜溫度，認(rèn)為黑水虻孵化的最佳溫度為32℃，此溫度下孵化歷期最短、初孵幼蟲最多[8]。參照其研究結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)將冷藏過(guò)后的蟲卵轉(zhuǎn)置于32 ℃的環(huán)境中孵化，以蟲卵孵化80%為基準(zhǔn)線驗(yàn)證發(fā)育階段對(duì)蟲卵冷藏后孵化率及幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以期為黑水虻規(guī)?；a(chǎn)苗種培育環(huán)節(jié)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試蟲卵 黑水虻蟲卵由廣州安芮潔環(huán)保科技有限公司提供。幼蟲取食餐廚垃圾，飼養(yǎng)溫度為30（±2） ℃。成蟲飼養(yǎng)溫度為28 （±3）℃，相對(duì)濕度為50%～90%，自然光照。待成蟲交配，采集集卵板上的初產(chǎn)卵塊，卵塊的產(chǎn)卵間期不超過(guò)2 h。試驗(yàn)于2018年6月至2019年3月在廣州安芮潔環(huán)?？萍加邢薰緦?shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 幼蟲飼料 初孵幼蟲取食含水量70%的麩皮，5～15日齡幼蟲取食含水量75%的餐廚漿料。幼蟲飼料及試養(yǎng)方法由廣州安芮潔環(huán)保科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑水虻蟲卵胚胎發(fā)育期 參照莫文艷等的方法，單克初產(chǎn)蟲卵采用41 000個(gè)卵粒進(jìn)行養(yǎng)殖參數(shù)計(jì)算。黑水虻蟲卵在32 ℃氣候箱（寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，PRX-350B）發(fā)育8.5 h形成“瓶”狀的胚帶，發(fā)育13 h為原腸形成期，發(fā)育30 h體壁開始背合，48 h后為破殼期。

1.2.2 蟲卵冷藏與孵化 收集產(chǎn)卵時(shí)間相差不超過(guò)2 h的蟲卵9 g，用分析天平稱量18份0.5 g的樣品平鋪（鋪放厚度不高于3 mm）在小培養(yǎng)皿內(nèi)，試驗(yàn)設(shè)冷藏初產(chǎn)蟲卵、冷藏胚盤胚帶形成期蟲卵、冷藏原腸期蟲卵、冷藏體壁背合期蟲卵、冷藏破殼期蟲卵、32℃直接孵化的初產(chǎn)蟲卵（對(duì)照）6個(gè)處理，分別記為A、B、C、D、E、CK，每個(gè)處理3次重復(fù)。除處理A外，其余處理均置于孵化氣候箱（32℃，RH 80%，光周期14L∶10D）保存。隨后立即對(duì)處理A進(jìn)行鏡檢，記錄蟲卵發(fā)育階段和存活率后放置到冷藏氣候箱。隔6 h，從孵化氣候箱取出處理B鏡檢；隔13 h取出處理C鏡檢；隔30 h取出處理D鏡檢；隔40 h取出處理E鏡檢，各自鏡檢完畢后均放置到12℃冷藏氣候箱保存。對(duì)照一直置于32℃的孵化氣候箱，直至自然孵化。對(duì)放進(jìn)冷藏氣候箱冷藏的各處理，每隔24 h，隨機(jī)取樣置于載玻片上，每個(gè)載玻片上100個(gè)蟲卵，3次重復(fù)，將載玻片放入孵化氣候箱進(jìn)行孵化，每天鏡檢發(fā)育情況，利用顯微鏡計(jì)數(shù)未孵化卵數(shù)（D），計(jì)算孵化率（S），直至孵化率低于80%。

1.2.3 原腸期卵冷藏處理及初孵幼蟲總重測(cè)定 在12個(gè)直徑為10 cm的孔徑0.180 mm分級(jí)篩上分別稱量1 g初產(chǎn)蟲卵置于孵化氣候箱，發(fā)育到原腸期后轉(zhuǎn)移到冷藏氣候箱分別冷藏0、5、10、15 d（4個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)），而后轉(zhuǎn)移回到孵化氣候箱。將分級(jí)篩放在直徑為15 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)部四周邊緣均勻撒3 g玉米粉。待幼蟲孵化后，稱量初孵幼蟲和玉米粉的總質(zhì)量，計(jì)算初孵幼蟲質(zhì)量。然后將初孵幼蟲和玉米粉一起撒到250 g含水量70%的麩皮上方（麩皮厚度約10 cm，置于容器中部，容器為40 cm×60 cm×10 cm的塑料盒），并用勺子輕輕撥開初孵幼蟲，避免玉米粉結(jié)球發(fā)粘導(dǎo)致幼蟲死亡。

1.2.4 不同冷藏時(shí)間原腸期卵5日齡幼蟲存活率 養(yǎng)殖5 d，幼蟲取食完開口料后，利用幼蟲避光的習(xí)性，將堆積在幼蟲表面的麩皮殘?jiān)p輕抹去，直至只剩幼蟲。然后將麩皮殘?jiān)旁诳讖?.250 mm篩網(wǎng)上，篩網(wǎng)放在陽(yáng)光下，讓殘?jiān)鼉?nèi)殘留的極少量幼蟲掉落到篩網(wǎng)下方的培養(yǎng)皿內(nèi)。將收集到的幼蟲稱量總重，隨機(jī)取樣3個(gè)，用分析天平稱量并記錄重量（每個(gè)樣品重量約0.1 g），計(jì)數(shù)幼蟲數(shù)量，計(jì)算5日齡幼蟲存活率：

1.2.5 冷藏5、10、15 d原腸期卵15日齡幼蟲存活率和幼蟲重量 初孵幼蟲在麩皮中取食5 d將幼蟲輕輕篩出并轉(zhuǎn)移到1 kg含水量70%的餐廚漿料（漿料厚度約3 cm，置于容器中部，容器為50 cm×50 cm×15 cm的面包框內(nèi)裝著0.180 mm孔徑的紗網(wǎng)網(wǎng)兜）上飼養(yǎng)。漿料視取食情況進(jìn)行補(bǔ)料，當(dāng)新鮮漿料都變成灰褐色時(shí)再補(bǔ)1 kg，養(yǎng)殖過(guò)程中，各處理合計(jì)投喂?jié){料16 kg。幼蟲13日齡時(shí)停止補(bǔ)料進(jìn)行饑餓處理，幼蟲15日齡時(shí)用孔徑0.425 mm篩將幼蟲與殘?jiān)蛛x，稱量總重后，隨機(jī)取 100 頭進(jìn)行稱重，計(jì)算單頭幼蟲平均體重（稱量后放回飼養(yǎng)盒）。計(jì)算幼蟲養(yǎng)殖存活率：

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用LSD多重比較進(jìn)行方差分析，采用Excel繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏時(shí)間對(duì)不同發(fā)育階段黑水虻蟲卵孵化率的影響

從圖1可以看出，冷藏時(shí)間對(duì)不同發(fā)育階段黑水虻蟲卵孵化率具有顯著影響，初產(chǎn)蟲卵（處理A）不能直接冷藏，冷藏1 d死亡率達(dá)100%。破殼期卵（處理E）不適于冷藏，冷藏3 d后幼蟲無(wú)法破殼。原腸期卵（處理C）孵化率＞80%的冷藏周期為15 d，顯著大于體壁背合期卵（處理D）的6 d和胚盤胚帶形成期卵（處理B）的13 d，故原腸期卵是較適合的冷藏階段。

圖1 冷藏時(shí)間對(duì)不同發(fā)育階段黑水虻蟲卵孵化率的影響Fig.1 Effects of cold storage time on hatching rate of Hermetia illucens at different developmental stages

2.2 原腸期蟲卵不同冷藏時(shí)間對(duì)黑水虻生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.2.1 原腸期不同冷藏時(shí)間對(duì)黑水虻不同時(shí)期幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響 隨著冷藏時(shí)間拉長(zhǎng)，部分初孵幼蟲由于活力不足，無(wú)法順利從紗網(wǎng)掉落到盆內(nèi)。稱量初孵幼蟲質(zhì)量可以從側(cè)面反映蟲卵的有效孵化率。冷藏15 d卵的初孵幼蟲質(zhì)量顯著低于對(duì)照（P=2.82e-6），詳見(jiàn)表1。

2.2.2 原腸期不同冷藏時(shí)間對(duì)黑水虻5日齡幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響 各處理初孵幼蟲養(yǎng)殖5 d后，篩分稱量總重、百頭重，計(jì)算冷藏0、5、10、15 d卵的5日齡幼蟲存活率。結(jié)果（表1）顯示各處理5日齡幼蟲百頭重?zé)o顯著差異（P=0.434），冷藏15 d的5日齡幼蟲存活率顯著低于對(duì)照（P=6.1e-7）。

2.2.3 原腸期不同冷藏時(shí)間對(duì)黑水虻15日齡幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響 將各處理收獲的5日齡幼蟲繼續(xù)養(yǎng)殖10 d后，篩分稱量總重、百頭重，計(jì)算15日齡幼蟲養(yǎng)殖存活率（此處的養(yǎng)殖存活率以5日齡幼蟲數(shù)為基數(shù)而非蟲卵數(shù)），結(jié)果（表1）顯示各處理15日齡幼蟲百頭重?zé)o顯著差異（P=0.187），冷藏15 d的15日齡幼蟲存活率顯著低于對(duì)照（P=0.024）。

表1 冷藏時(shí)間對(duì)黑水虻不同階段幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響Table 1 Effects of cold storage time on growth and development of Hermetia illucens larvae at different developmental stages

3 討論

黑水虻卵冷藏過(guò)程中，初產(chǎn)蟲卵無(wú)法發(fā)育直接死亡，可能是因?yàn)槌醍a(chǎn)蟲卵的發(fā)育起始溫度高于12 ℃。Holmes等研究認(rèn)為黑水虻卵發(fā)育的起始溫度在12～16 ℃[9]，然而其研究報(bào)道中未說(shuō)明蟲卵進(jìn)入冷藏階段時(shí)的發(fā)育情況，故我們推測(cè)初產(chǎn)蟲卵的發(fā)育起始溫度高于12 ℃。

黑水虻其他幾個(gè)發(fā)育階段的蟲卵經(jīng)12 ℃冷藏后，均能在32 ℃發(fā)育成幼蟲。但隨著冷藏時(shí)間推移，幼蟲無(wú)法正常破殼，死于卵殼內(nèi)。我們?cè)谘芯亢谒德雅咛グl(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)冷藏的蟲卵表面有一層粘液，正常發(fā)育的胚胎出殼前尾部會(huì)分泌一種疑似具有溶解卵殼功能的液體，幼蟲通過(guò)蠕動(dòng)身體把部分液體擠到頭頂，利用口器持續(xù)頂頭頂卵殼，直到出現(xiàn)裂縫，幼蟲從卵殼中爬出。而冷藏過(guò)后的蟲卵，表面粘液消失，在孵化時(shí)，未見(jiàn)尾部分泌液體，可能是黑水虻卵冷藏過(guò)程中失水所致。

黑水虻卵是一個(gè)大細(xì)胞，最外層為卵殼，卵殼下方為卵黃膜。卵殼或卵殼與卵黃膜間形成蠟質(zhì)層，卵殼與蠟質(zhì)層起到保護(hù)卵、防止卵內(nèi)水分過(guò)量蒸發(fā)和阻止水溶性物質(zhì)自由進(jìn)出的卵的作用[12]。我們?cè)诳諝鉂穸燃s50%，通風(fēng)優(yōu)良的環(huán)境中孵化蟲卵，發(fā)現(xiàn)孵化率極低，蟲卵死亡狀態(tài)與蟲卵冷藏時(shí)的死亡狀態(tài)類似，懷疑蟲卵冷藏過(guò)程中，卵殼或蠟質(zhì)層受損，卵內(nèi)水分大量蒸發(fā)，導(dǎo)致幼蟲無(wú)法正常破殼。我們后續(xù)加大冷藏濕度（90%）進(jìn)行試驗(yàn)，冷藏效果不理想，蟲卵表面易著落凝結(jié)的水珠，卵孵化率低。推想如果要進(jìn)一步增加蟲卵冷藏間期，需要從蟲卵保濕以及種蟲養(yǎng)殖繁育時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)等方面著手。

蟲卵冷藏對(duì)幼蟲的發(fā)育造成一定的影響，隨著冷藏時(shí)間增長(zhǎng)，孵化歷期加長(zhǎng)，初孵幼蟲活力變差甚至無(wú)法破殼，這使得后期養(yǎng)殖過(guò)程中，經(jīng)冷藏處理的幼蟲發(fā)育相對(duì)對(duì)照不整齊，這個(gè)現(xiàn)象在冷藏15 d時(shí)非常明顯。發(fā)育不整齊的幼蟲不適宜養(yǎng)殖為蛹用于繁育，故本實(shí)驗(yàn)未繼續(xù)作成蟲繁育方面的研究，如果冷藏技術(shù)有新進(jìn)展，不再影響幼蟲發(fā)育的整齊度，有待進(jìn)行冷藏卵的成蟲繁育方面研究。

從原腸期卵分別冷藏0、5、10、15 d對(duì)黑水虻生長(zhǎng)發(fā)育的影響結(jié)果中可以看出，各處理均存在蟲卵孵化率高、初孵幼蟲（1～5日齡）存活率低和幼蟲（5～15日齡）養(yǎng)殖存活率高的規(guī)律，與姬越等的報(bào)道相似[8]。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，孵化環(huán)境溫濕度、蟲卵鋪放厚度、飼料表面明水量、飼料透氣性等因素都對(duì)初孵幼蟲存活率具有較大影響，更全面的了解初孵幼蟲存活率的影響因素，提升初孵幼蟲存活率是黑水虻規(guī)?；B(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)的研究重點(diǎn)之一。

4 結(jié)論

在溫度為12 ℃、濕度為80 %的冷藏環(huán)境，經(jīng)冷藏后的初產(chǎn)蟲卵、體壁背合期和破殼期蟲卵發(fā)育受阻，孵化率降低；胚盤胚帶形成期蟲卵冷藏13 d內(nèi)孵化率＞80%；原腸期的黑水虻卵冷藏15 d內(nèi)能保持＞80%的孵化率，孵化出來(lái)的幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育正常，冷藏超過(guò)15 d，孵化率顯著降低，無(wú)法正常破殼。所以不同發(fā)育階段的蟲卵對(duì)低溫的耐受性不同，低溫對(duì)卵的傷害會(huì)隨卵的發(fā)育而減輕，冷藏即將發(fā)育完全或已經(jīng)發(fā)育完全的胚胎，胚胎無(wú)法正常破殼。