陳磊 張莉

山東齊魯醫(yī)藥學(xué)院，山東 淄博 255213

隨著年齡增加，人們?nèi)菀装l(fā)生骨質(zhì)疏松癥，當骨質(zhì)疏松合并骨折時，常表現(xiàn)出較高的骨折延遲愈合及不愈合發(fā)生率，這一直是困擾骨科治療的問題[1]。中醫(yī)藥治療骨傷歷史悠久，具有不良反應(yīng)少，療效明顯等優(yōu)點，廣泛用于骨質(zhì)疏松性骨折治療[2]。如張柳等[3]報道，麝香烏龍丸對骨質(zhì)疏松大鼠股骨骨折有明顯促進骨折愈合的作用。

續(xù)斷為川續(xù)斷科川續(xù)斷屬植物川續(xù)斷的根?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷、止崩漏、安胎等功效[4]。卿茂盛等[5]報道，續(xù)斷能改善骨質(zhì)疏松性骨折愈合骨痂的生物力學(xué)性能，促進骨折愈合。續(xù)斷促進骨折愈合的機制主要集中在通過促進成骨細胞堿性磷酸酶活性及BMP-2 的表達，提高血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性，升高鈣磷乘積，促進鈣鹽沉積，從而增強體內(nèi)成骨。而在骨折發(fā)生時常常伴有炎癥反應(yīng)，有關(guān)續(xù)斷對骨折愈合中的炎癥反應(yīng)的影響還未見報道。本實驗通過分析骨質(zhì)疏松骨折中炎癥因子的變化，觀察續(xù)斷對炎癥因子的影響，為續(xù)斷的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

續(xù)斷(Xuduan)購自山東省藥材公司，并經(jīng)過專家鑒定為正品。續(xù)斷水煎劑：續(xù)斷水煎煮3次，每次1 h，煎煮液過濾，濾液合并，濃縮至相對密度1.00～1.10時，40 ℃左右加入乙醇，邊加邊攪拌使醇量達40%，冷藏靜置48 h，離心過濾，沉淀物再用40%乙醇攪拌，冷藏靜置一夜，離心過濾，濾液與上一次乙醇濾液合并，濃縮(揮去乙醇)，進一步濃縮至每毫升含生藥20 g，分裝，藥物避光，4 ℃冰箱保存。骨源性堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase, BALP)試劑盒(批號：20170515)， 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF -α)試劑盒(批號：20170421),白介素-1(Interleukin-1，IL-1β)試劑盒(批號：20170425)和白介素-6(Interleukin -6，IL-6)試劑盒(批號：20170526)，HE染色試劑盒(批號：20170225)均購自南京建成生物工程研究所。

HOLOGIC4 500 A型雙能X線骨密度掃描儀(Hologic公司，美國)。徠卡病理系統(tǒng)(Leica公司，德國)。

1.2 動物模型制備與分組

雌性SD大鼠50只，清潔級，體質(zhì)量為200～250 g，由山東省實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(魯)2014 0006。隨機分為5組：常規(guī)骨折組、骨質(zhì)疏松性骨折組、續(xù)斷治療組(高劑量組和低劑量組)、雌激素組，每組10只。一般性骨折組行假手術(shù)，其他各組大鼠行背部雙側(cè)去卵巢術(shù)切除雙側(cè)卵巢，造成骨質(zhì)疏松模型。術(shù)后3個月，各組動物均用10%水合氯醛麻醉后，取右下肢股外側(cè)切口暴露股骨干，于股骨中段用鋼鋸將股骨橫行鋸斷，以直徑1 mm克氏針固定，依次縫合關(guān)閉切口，建立大鼠右側(cè)股骨中段骨折模型。根據(jù)續(xù)斷臨床用量為6～15 g/kg，大鼠和人的等量比值是6.3(照大鼠體表面積換算)，臨床最大等效劑量為1.58 g/kg，大鼠實驗常規(guī)采用臨床劑量的5～30倍，7.9～47.4 g/kg，在這個范圍取兩個給藥劑量為20 g和10 g續(xù)斷生藥/kg體重。雌激素組給藥劑量為0.125 mg/kg體重；灌胃給藥，常規(guī)骨折組和骨質(zhì)疏松骨折組給予等體積的生理鹽水灌胃。灌胃4周后，分別將受試大鼠采用1%戊巴比妥鈉麻醉，主動脈取血，離心10 min(3 000 r/min)分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。處死大鼠，解剖取出右?cè)股骨，剔凈軟組織后分別置雙能X線骨密度儀掃描整個股骨標本，記錄下骨密度數(shù)據(jù)，然后用生理鹽水沖洗置股骨標本固定于4%的多聚甲醛，然后加入含5.5%EDTA的10%中性福爾馬林溶液進行脫鈣，待做病理檢查。

1.3 觀察指標

1.3.1血清BALP活性、TNF-α、IL-1和IL-6水平檢測：取冰凍血清解凍，采用發(fā)色底物法測定血清 BALP活性，采用雙抗夾心法測定血清TNF-α、IL-1和IL-6水平。

1.3.2HE染色觀察骨痂微結(jié)構(gòu)：脫鈣完成后的標本進行常規(guī)的包埋、切片、脫蠟，使用蘇木精原伊紅染液進行染色，光鏡下隨機選取兩組骨折線處骨痂組織高倍視野(×200)拍照，并觀察骨折骨痂切面單位視野內(nèi)的骨小梁、軟骨細胞、骨基質(zhì)等，進行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

實驗過程中各組大鼠進食飲水正常，狀況良好，骨折手術(shù)時，由于受麻醉劑的影響，進食量降低，體重增長緩慢，其余時間無異常。大鼠的兩次手術(shù)切口均在1 周后愈合。實驗過程中均無動物死亡。

2.2 骨密度測量結(jié)果

測定各組動物的骨密度發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松骨折組、雌激素治療組和續(xù)斷治療組大鼠股骨骨密度值顯著低于常規(guī)骨折組(P<0.05)，提示骨質(zhì)疏松造模成功；續(xù)斷治療組和常規(guī)骨折組、雌激素治療組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明續(xù)斷有促進骨密度增加的作用，結(jié)果見表1。

2.3 各組大鼠血清中BALP、TNF-α、IL-1和IL-6水平

與常規(guī)骨折組比較，骨質(zhì)疏松骨折組TNF-α、IL-1和IL-6水平均明顯升高，BALP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與骨質(zhì)疏松骨折組比較，雌激素和續(xù)斷治療組降低了TNF-α、IL-1水平，升高IL-6水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中高劑量組作用最明顯，部分指標接近雌激素組，具體結(jié)果見表2。

組別 股骨骨密度/(g/cm2) 常規(guī)骨折組0.155±0.005骨質(zhì)疏松骨折組0.141±0.003?雌激素治療組(0.125 mg/kg)0.156±0.006#續(xù)斷治療高劑量組(20 g/kg)0.155±0.005#續(xù)斷治療低劑量組(10 g/kg)0.153±0.004#

注：與常規(guī)骨折組比較，*P<0.05；與骨質(zhì)疏松骨折組比較，#P<0.05。

組別BALP/(U/L)TNF-α/(ng/L)IL-1/(μg/L)IL-6/(μg/L)常規(guī)骨折組74.66±5.6792.41 ±8.76118.05±24.35935.49±32.67骨質(zhì)疏松骨折組54.38±4.62?144.32±9.78?186.83±55.34?1239.03±68.57?雌激素治療組(0.125 mg/kg)75.35 ±6.29#98.46 ±7.39#116.27±28.16#928.53±37.49#續(xù)斷治療高劑量組(20 g/kg)68.42±5.18#104.85±8.11#123.43±35.44#958.82±52.73#續(xù)斷治療低劑量組(10 g/kg)61.02±5.76#122.46±9.83#145.23±42.41#1038.26±61.22#

注：與常規(guī)骨折組比較，*P<0.05；與骨質(zhì)疏松骨折組比較，#P<0.05。

2.4 病理組織學(xué)結(jié)果

骨痂組織HE染色光鏡觀察：常規(guī)骨折組骨小梁分布較規(guī)則，厚度均勻致密，間距小，排列有序，軟骨性骨痂已逐漸被骨性骨痂取代，形成片狀骨。而骨質(zhì)疏松性骨折組骨小梁分布不規(guī)則，較細，髓腔間隙較大，呈疏松化表現(xiàn)，有炎癥細胞分布。與骨質(zhì)疏松性骨折組比較，雌激素治療組和續(xù)斷治療組骨小梁數(shù)量多，形狀更粗，間距更小，炎細胞較少， 軟骨細胞骨化占比高，高劑量組作用最為明顯，結(jié)果見圖1。

圖1 骨折大鼠骨痂組織HE染色(×200) A：一般骨折對照組；B：骨質(zhì)疏松性骨折模型組；C：雌激素治療組；D：續(xù)斷治療高劑量組；E：續(xù)斷治療低劑量組。Fig.1 HE results of postoperative femoral callus in rats (×200). A: The conventional fracture group; B: The osteoporotic fracture group; C: Estrogen group; D: Xuduan high dose treatment group; E: Xuduan low dose treatment group.

3 討論

程志安等[6]報道，續(xù)斷水煎劑能顯著促進成骨細胞的增殖、增加堿性磷酸酶的表達及礦化結(jié)節(jié)形成的數(shù)量，促進成骨細胞骨鈣素和Ⅰ型前膠原mRNA的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷能增加血清中骨源性堿性磷酸酶水平，促進骨質(zhì)疏松性骨折骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度，軟骨細胞骨化明顯，促進骨折愈合。這個結(jié)果與以前的研究結(jié)果一致，顯示了其強骨作用。續(xù)斷主要含有三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類等[4]。劉二偉等[7]報道，水煎液中總皂苷是促進骨傷愈合的活性成分，續(xù)斷乙醇提取物對成骨細胞有明顯的增殖作用，說明中藥續(xù)斷的兩種組分對成骨細胞的增殖均具有促進作用。

骨折愈合是破骨與成骨動態(tài)平衡的過程，成骨性細胞和破骨性細胞主導(dǎo)這個過程，而它們二者又受細胞因子作用，由于骨折是常伴有組織損傷，必然發(fā)生炎癥反應(yīng)，所以炎癥因子常常參與骨折過程。炎性細胞因子與低骨量和骨折危險性有關(guān)，多種炎性因子包括TNF-α、IL-1等可以刺激破骨細胞分化形成[8]。本次實驗也發(fā)現(xiàn)，骨折模型組的炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6水平增高，證實了骨折時炎癥因子升高。有關(guān)抗炎治療，常規(guī)的抗炎藥有效，其實中藥也有抗炎作用。有關(guān)研究[9]表明，苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用與它們在一定劑量范圍內(nèi)劑量依賴性地抑制MF經(jīng)LPS刺激產(chǎn)生 TNF-α有關(guān)，黃芪總黃酮抗大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用除與NO的量有關(guān)外, 也與其降低滑膜細胞內(nèi) IL-1、IL-6水平相關(guān)。

黃濱等[10]報道，續(xù)斷70%乙醇提取物能顯著抑制大鼠蛋清性腳腫脹、二甲苯所致的小鼠耳部炎癥。本次實驗發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷可降低TNF-α、IL-1、IL-6水平，增加骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度，說明續(xù)斷有抗炎作用，通過降低炎癥因子TNF-α，IL-1對破骨細胞的刺激，降低破骨細胞的活化，從而有利于骨折愈合。續(xù)斷的主要成分是三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類等，具體哪一種成分起作用還不好確定，因為這些成分都有抗炎作用的相關(guān)報道[9-10]。由于中藥成分復(fù)雜，一味中藥往往含有多種抗炎成分,能經(jīng)多種途徑達到抗炎治療作用，所以續(xù)斷可能通過多種成分共同作用發(fā)揮抗炎作用。

總之，在骨質(zhì)疏松骨折愈合過程中，續(xù)斷可通過多方式降低炎癥因子的水平，進一步影響骨折愈合。