李青霞，張玉彬

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211198）

對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）又名撲熱息痛，是一種常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，自1955年應(yīng)用于臨床后就成為歐洲最受歡迎的解熱鎮(zhèn)痛藥[1-3]，并一直占據(jù)解熱鎮(zhèn)痛藥原料藥市場的主導(dǎo)地位，以單組分或復(fù)方的形式被應(yīng)用到多種治療感冒、發(fā)熱和緩解疼痛的藥物中，全世界每年的消耗量達(dá)75 000～80 000噸。1966年，首次發(fā)現(xiàn)APAP可引起肝損傷[4]。目前在美國，APAP已經(jīng)成為引起急性肝功能衰竭最多的藥物，而在我國，APAP是僅次于乙型肝炎病毒引起肝功能衰竭的重要因素[5]。另外，我國酒精性和非酒精性肝病發(fā)病率逐年升高，這類患者肝臟氧化還原平衡遭到破壞，對APAP的耐受降低，亦增加服食APAP患者用藥風(fēng)險[6-8]。除此之外，Gong等[9]研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物比例的晝夜差異可導(dǎo)致微生物代謝產(chǎn)物——1-苯基-1，2-丙二酮（1-phenyl-1，2-propanedione，PPD）在夜間含量升高，而PPD轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟會消耗肝臟谷胱甘肽（glutathione,GSH），導(dǎo)致相同劑量的APAP在夜間引發(fā)更加嚴(yán)重的肝損傷，而夜間發(fā)病很容易使患者失去最佳的救治時間，因此，APAP毒性的時辰問題在臨床使用中應(yīng)加以關(guān)注。此外，路燕等[10]利用美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research, ICR）小鼠模擬APAP肝損傷時發(fā)現(xiàn)，相同劑量的APAP對成年的雄鼠所致的肝損傷較雌鼠嚴(yán)重，故APAP肝毒性的易感性和嚴(yán)重程度受到了多方面因素的影響，且APAP中毒早期臨床表現(xiàn)不明顯，往往導(dǎo)致了APAP中毒難以防治。

線粒體是真核生物進(jìn)行氧化代謝產(chǎn)生能量的細(xì)胞器，它對氧化損傷極為敏感，缺氧、微生物毒素、各種毒物以及射線、滲透壓改變等均會導(dǎo)致線粒體腫脹。APAP造成的肝損傷一般可分為代謝損傷階段和炎癥損傷階段。線粒體作為APAP代謝產(chǎn)物的主要靶標(biāo)，參與到APAP引起的代謝損傷和炎癥損傷2個階段，在代謝與免疫反應(yīng)中均發(fā)揮了重要的橋梁作用。因此，線粒體也成為“代謝免疫（immunometabolism）”這一新興的學(xué)科分支重要的研究對象。本文主要從線粒體損傷出發(fā)，探討APAP造成肝損傷甚至急性肝衰竭的機(jī)制以及與線粒體損傷相關(guān)的潛在治療方案。

1 對乙酰氨基酚損傷肝臟線粒體的機(jī)制

1.1線粒體與氧化應(yīng)激

線粒體是一種由2層膜包被的細(xì)胞器，由外至內(nèi)可劃分為線粒體外膜、線粒體膜間隙、線粒體內(nèi)膜和線粒體基質(zhì)4個功能區(qū)，除作為細(xì)胞的“能量工廠”外，也參與細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過程，并擁有調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的能力。線粒體在通過氧化磷酸化產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）時，呼吸鏈中傳遞的電子很容易從線粒體內(nèi)膜漏出，與線粒體基質(zhì)中的氧結(jié)合生成超氧陰離子（˙O2-），再轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基自由基（· OH）和過氧化氫（H2O2），這三者是細(xì)胞內(nèi)最強(qiáng)的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）成員。細(xì)胞內(nèi)80%的ROS來自線粒體，因此，生物進(jìn)化時，線粒體內(nèi)保留了一套完整的ROS防御系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、 谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GRX）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）等，這些生物分子可及時消除線粒體內(nèi)產(chǎn)生的過量ROS，但當(dāng)線粒體受損傷時，則會產(chǎn)生持續(xù)性高濃度的ROS，導(dǎo)致線粒體膜脂質(zhì)和線粒體DNA氧化受損，從而引起炎癥反應(yīng)。

1.2 對乙酰氨基酚在肝臟內(nèi)的代謝

藥物在肝臟進(jìn)行的代謝轉(zhuǎn)化一般可以分為Ⅰ相代謝反應(yīng)和Ⅱ相代謝反應(yīng)，Ⅰ相代謝反應(yīng)包括氧化、還原、水解和去甲基化，可將藥物代謝為具有肝細(xì)胞毒性的產(chǎn)物。Ⅱ相代謝反應(yīng)為結(jié)合反應(yīng)，藥物或Ⅰ相代謝反應(yīng)產(chǎn)物與葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽等內(nèi)源性物質(zhì)共價結(jié)合，增強(qiáng)物質(zhì)極性，使其易于通過尿液排出體外，即藥物解毒的過程。1973年Mitchell等[11]通過APAP動物模型揭示了APAP的代謝過程，在治療劑量下，APAP主要通過Ⅱ相代謝途徑代謝，85% ～ 90%的APAP在葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（glucuronic transferase，UGTs）和磺基轉(zhuǎn)移酶（sulfonate transferase，SULTs）的催化下與葡萄糖醛酸和硫酸物結(jié)合，生成無毒的代謝物，10%的APAP經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450系統(tǒng)代謝，產(chǎn)生有毒的活性中間體N-乙酰對苯醌亞胺（N-acetylp-benzoquinone imine，NAPQI），正常量的NAPQI在谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S transferase,GST）的催化下能夠結(jié)合谷胱甘肽產(chǎn)生無毒的硫醇尿酸，通過尿液排出體外，4%的APAP以其原型從尿液中排出體外。另外，還有極小比例的APAP會被髓過氧化物酶或環(huán)氧酶-1氧化[1,12]。肝臟作為體內(nèi)以代謝為主的器官，攝入的各類物質(zhì)在影響肝臟健康狀態(tài)的同時也會影響APAP的代謝。有研究顯示，由于酒精也通過CYP2E1進(jìn)行代謝，長期飲酒會增強(qiáng)CYP2E1的活性或延長其半衰期，促進(jìn)細(xì)胞色素 P4502E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）對APAP的代謝，產(chǎn)生更多的NAPQI，導(dǎo)致肝臟對APAP的耐受降低,但研究發(fā)現(xiàn)，急性的酒精攝入或許能夠通過競爭CYP2E1來緩解APAP造成的肝損傷[1]。因此，酒精攝入對于APAP肝損傷的影響還有待進(jìn)一步探究。此外，多種食物也會影響CYP450酶活性，故在臨床使用APAP的過程中應(yīng)多加關(guān)注。

1.3 代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并破壞線粒體防御體系

APAP代謝產(chǎn)生過量NAPQI，在造成氧化應(yīng)激的同時能夠結(jié)合線粒體和肝臟細(xì)胞蛋白，破壞線粒體和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，損傷線粒體功能并阻礙新的線粒體生成，導(dǎo)致肝臟內(nèi)線粒體防御體系受損。美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）建議成人每天攝入的APAP應(yīng)少于4 g，超出UGTs和SULTs代謝能力的APAP主要通過細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)中CYP2E1代謝，也有少量由CYP1A2/3A4代謝，產(chǎn)生大量的NAPQI[1]。線粒體是NAPQI的主要靶標(biāo)，一方面過量的NAPQI通過半胱氨酸殘基結(jié)合到線粒體膜蛋白上形成APAP復(fù)合物[13]，改變線粒體膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，破壞膜電位；另一方面，NAPQI消耗大量的GSH，破壞肝臟氧化還原平衡，從而使線粒體中ROS水平升高，導(dǎo)致線粒體膜脂質(zhì)過氧化，膜流動性降低。GSH耗竭導(dǎo)致未被及時清除的ROS激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）并使其轉(zhuǎn)位進(jìn)入線粒體，持續(xù)激活的JNK促進(jìn)線粒體不斷地產(chǎn)生ROS，ROS和JNK的相互作用增強(qiáng)了線粒體氧化應(yīng)激[14]。核因子E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid 2-related factor-2，Nrf2）作為體內(nèi)主要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，受到刺激能夠入核誘導(dǎo)其下游包括解毒、抗氧化以及藥物代謝相關(guān)基因的表達(dá)；低劑量APAP能夠激活Nrf2，使其入核誘導(dǎo)下游抗氧化基因的表達(dá)，發(fā)揮對肝臟的保護(hù)作用，但攝入過量的APAP會抑制Nrf2的表達(dá)，故大劑量的APAP代謝產(chǎn)物不僅消耗谷胱甘肽儲備，同時還破壞機(jī)體抗氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致肝臟的抗氧化防御系統(tǒng)崩潰[15]。

由于細(xì)胞中80%的ROS都來自線粒體，線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整有助于線粒體固有的ROS防御系統(tǒng)發(fā)揮作用，但張廷芬等[16]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的APAP會影響線粒體的呼吸功能，且由ROS激活的JNK亦能結(jié)合到線粒體，通過下調(diào)丙酮酸脫氫酶的活性，從而降低線粒體代謝。Barbier-Torres等[17]也發(fā)現(xiàn)，APAP中毒患者體內(nèi)內(nèi)源性線粒體負(fù)性調(diào)節(jié)因子——MCJ的水平顯著升高，MCJ是一種定位于線粒體內(nèi)膜的跨膜蛋白，可與線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ相互作用，從而降低其活性，APAP能夠通過MCJ干擾線粒體呼吸復(fù)合物的形成，在減少ATP合成的同時增加ROS的生成。另外，過量APAP代謝產(chǎn)生的NAPQI能夠選擇性地抑制線粒體復(fù)合物Ⅱ的正常功能，同時NAPQI能夠與ATP合酶的α亞基結(jié)合，破壞其生物活性，使ATP合成受損[2,18]。APAP在體內(nèi)由3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸作為硫酸的供體，在葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的催化下代謝為無毒的產(chǎn)物排出體外。由于3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸是由含硫氨基酸提供硫酸基團(tuán)并與ATP反應(yīng)生成，ATP合成受損可能會減弱SULTs對APAP的代謝，導(dǎo)致更多的APAP經(jīng)CYP2E1代謝，從而放大NAPQI對線粒體的氧化損傷。

在正常生理狀態(tài)下，過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator 1α，PGC-1α）作為促進(jìn)線粒體生成的主要調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)控線粒體的數(shù)量與形態(tài)[19]。研究顯示，乙酰肉毒堿能夠通過PGC-1α調(diào)控線粒體生成[20]。張廷芬等[16]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的APAP能夠誘導(dǎo)PGC-1α的表達(dá)，同時也促進(jìn)核呼吸因子1/2（nuclear respiratory factor1/2，NRF-1/2）以及下游線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，MTFA）的表達(dá)，進(jìn)而抵抗線粒體損傷，緩解APAP造成的肝損傷，但高濃度的APAP會抑制PGC-1α、NRF-1/2和MTFA的表達(dá)，減少線粒體生成，表明APAP通過代謝活性中間產(chǎn)物NAPQI，不僅能夠消耗GSH，造成氧化應(yīng)激，破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，亦能阻礙線粒體的生成，導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體數(shù)量和功能異常。

1.4 代謝產(chǎn)物通過線粒體介導(dǎo)肝臟炎癥損傷

肝臟作為體內(nèi)固有免疫的主要器官之一，不僅含有大量的內(nèi)源性巨噬細(xì)胞，即枯否細(xì)胞（Kupffer cells，KCs），且能夠快速募集循環(huán)系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞進(jìn)入肝臟發(fā)揮免疫作用。Nod樣受體蛋白3（Nodlike recepter protein 3，NLRP3）炎性小體的激活能控制促炎因子白細(xì)胞介素-1β/18（interleukin -1β/18,IL-1β/18）的成熟和分泌，其活化依賴于“啟動”和“激活”2個功能不同的步驟[21]。Zhong等[22]在研究炎癥小體NLRP3激活的過程中發(fā)現(xiàn)，損傷線粒體生成的ROS能氧化線粒體DNA（mitochondria DNA，mtDNA）生成氧化型mtDNA（Ox-mtDNA），Ox-mtDNA可結(jié)合并激活NLRP3，促進(jìn)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前體（pro-caspase1）的成熟，進(jìn)而切割白細(xì)胞介素-1β/18前體（pro-interleukin-1β/18，pro-IL-1β/18），使其成熟并釋放到胞外發(fā)揮免疫作用；另外，激活Toll 樣受體4/9（Toll-like receptor 4/ 9，TLR4/9）信號產(chǎn)生 pro-IL-1β和 pro-IL-18的同時能夠通過髓樣分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF）激活干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor 1，IRF1）依賴的胞苷單磷酸激酶2（cytidine/uridine monophosphate kinase 2，CMPK2）轉(zhuǎn)錄，增加mtDNA的合成，促進(jìn)由NLRP3介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

在APAP中毒破壞肝臟的過程中，活性代謝產(chǎn)物NAPQI既能消耗GSH，提高肝臟內(nèi)ROS的水平，亦能與線粒體蛋白結(jié)合，破壞線粒體導(dǎo)致線粒體DNA釋放，機(jī)體免疫系統(tǒng)能夠通過TLR9識別mtDNA并使其激活，同時釋放包括凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor, AIF）和核酸內(nèi)切酶G（endonuclease G，Endo G）在內(nèi)的間質(zhì)蛋白，并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，從而使DNA發(fā)生碎片化，導(dǎo)致mtDNA、ATP、DNA碎片等細(xì)胞內(nèi)容物作為損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），刺激KCs，為NLRP3活化的啟動和激活階段提供條件，最終導(dǎo)致固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的發(fā)生[23]。一般認(rèn)為，激活KCs能夠加劇APAP導(dǎo)致的肝損傷，但免疫反應(yīng)亦能夠通過清除壞死細(xì)胞促進(jìn)肝臟的修復(fù)，因此免疫反應(yīng)能在肝臟中發(fā)揮損傷和修復(fù)的雙重功能，但持續(xù)和過量的炎癥反應(yīng)會加劇肝細(xì)胞的損傷和壞死。

2 緩解肝線粒體損傷的藥物研究

2.1 抗氧化藥物

2.1.1N-乙酰半胱氨酸 在目前的臨床治療中，N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是對APAP中毒具有明確療效的解毒劑，可以用于所有APAP過量中毒的患者[1]。NAC進(jìn)入細(xì)胞后，可脫去乙?；蒐-半胱氨酸，L-半胱氨酸是GSH的合成前體，能夠與甘氨酸和谷氨酸結(jié)合生成GSH，同時NAC中含有巰基，是GSH的活性基團(tuán)，易被氧化脫氫，能夠代替GSH與APAP的代謝物NAPQI共價結(jié)合，從而發(fā)揮直接解毒作用；另外NAC能提供合成磺酸基的原料，磺酸基能與APAP結(jié)合而解毒[1,5]。但NAC一般用于疾病發(fā)生的早期，在過量服用APAP后的10 ～ 12 h內(nèi)能阻止肝損傷的發(fā)生，但對于無意識服用大量APAP的患者以及中毒晚期患者治療效果有限[3]。然而，也有文獻(xiàn)報道，在疾病發(fā)展后期，NAC可能通過提高NO的產(chǎn)生，改善肝臟灌注和供氧，同時清除活性氧和活性氮，改善線粒體的能量供應(yīng)，從而降低APAP急性肝衰竭患者的死亡率[24]。

2.1.2 天然活性物質(zhì) 氧化應(yīng)激為APAP導(dǎo)致肝損傷的重要環(huán)節(jié)，已有大量文獻(xiàn)報道具有抗炎和抗氧化能力的天然提取物能夠預(yù)防APAP導(dǎo)致的急性肝損傷（見表1）。

表 1 部分植物提取物緩解對乙酰氨基酚肝損傷的作用機(jī)制Table 1 Mechanism of certain plant extracts in alleviating acetaminophen liver injury

然而，值得注意的是，有關(guān)天然活性物質(zhì)的研究仍停留在預(yù)防階段，且Salminen等[30]研究顯示，在灌胃給予小鼠150 mg·kg-1的APAP 6 h后再給予小鼠綠茶提取物加重了APAP導(dǎo)致的肝毒性，因此具有抗氧化活性的天然提取物對APAP肝毒性的治療效果仍需進(jìn)一步研究。

2.2 靶向線粒體緩解對乙酰氨基酚肝毒性

APAP中毒可導(dǎo)致線粒體功能受損，利用電子傳遞鏈復(fù)合物以及相關(guān)酶的類似物能夠修復(fù)線粒體功能，緩解APAP導(dǎo)致的肝損傷。四甲基哌啶氮氧化物（2，2，6，6-tetramethyl-1-piperidinyloxy，TEMPO）可以作為SOD的類似物，通過與親脂性的三苯基膦離子結(jié)合靶向進(jìn)入線粒體，從而改善線粒體抗氧化的功能[31]。Du等[32]給予C57BL/6J小鼠腹腔注射 300 mg·kg-1的APAP，1.5 h后給予線粒體靶向抗氧化劑——Mito-TEMPO（MT），發(fā)現(xiàn)MT能減少肝臟谷胱甘肽二硫化物以及過氧亞硝酸鹽的形成，并抑制線粒體Bax的轉(zhuǎn)移以及線粒體內(nèi)膜蛋白（如凋亡誘導(dǎo)因子）的釋放，抑制核DNA的片段化，進(jìn)而緩解3 ～ 12 h內(nèi)APAP導(dǎo)致的肝損傷。進(jìn)一步研究顯示，MT在APAP中毒12 h和24 h后仍能夠發(fā)揮保護(hù)作用，然而在MT處理的小鼠肝臟中雖未見細(xì)胞壞死，但細(xì)胞凋亡顯著增加，且MT組半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase 3）的切割和活化顯著提高，表明MT能通過調(diào)節(jié)線粒體氧化應(yīng)激和受體結(jié)合絲氨酸蘇氨酸激酶3（receptor binds serine threonine kinase 3，RIP3）的表達(dá)，將細(xì)胞死亡的方式由壞死轉(zhuǎn)化為繼發(fā)性凋亡，從而能夠減少由壞死細(xì)胞釋放的細(xì)胞內(nèi)容物對肝細(xì)胞的損傷[33]。

此外，亞甲藍(lán)作為一種用于臨床的解毒劑，可以通過滲透線粒體膜，作為電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅱ的替代品，維持線粒體電子傳遞鏈穩(wěn)態(tài)和線粒體生物能量平衡[18]。Lee 等[18]研究表明 ,小于 3 μmol·L-1的亞甲藍(lán)就能夠接受NAPQI的電子，恢復(fù)線粒體ATP合成速率。在正常情況下，亞甲藍(lán)能夠阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)變以及細(xì)胞內(nèi)ATP的缺失。C57BL/6J小鼠在給予450 mg·kg-1APAP 90 min后腹腔注射給予10 mg·kg-1的亞甲藍(lán)能夠緩解APAP造成的肝損傷[18]。并且亞甲藍(lán)在體內(nèi)被還原后能夠?qū)⒏哞F血紅蛋白還原為血紅蛋白，緩解APAP造成的高鐵血紅蛋白血癥[34-35]。

目前，雖然針對線粒體修復(fù)的解毒劑能夠治療APAP中毒，其療效甚至超過NAC，如MT與NAC聯(lián)合使用的療效較NAC單獨(dú)使用更好[32]，且利用MCJ的抑制劑能夠在NAC治療無效的情況下緩解APAP導(dǎo)致的肝毒性[17]。但上述藥物多處于體外研究階段，僅能作為探索治療APAP中毒藥物的研究方向，尚不能直接用于臨床。

2.3 線粒體移植治療

線粒體治療(mitochondrial therapy，mitotherapy）是利用外源的功能性線粒體替換有功能障礙的線粒體，從而達(dá)到治療線粒體相關(guān)疾病的目的。Shi等[36]將從HepG2中分離得到的功能性線粒體加入到APAP造模的細(xì)胞培養(yǎng)基中后發(fā)現(xiàn)，外源線粒體能夠進(jìn)入到體外培養(yǎng)的肝原代細(xì)胞中，并能顯著提高APAP處理后細(xì)胞的活力，同時還能夠降低ROS的水平，增強(qiáng)ATP的合成，提高GSH的水平。通過靜脈注射將外源的功能性線粒體注射進(jìn)小鼠體內(nèi)后，線粒體會分布到包括肝臟在內(nèi)的多種組織中，通過這一技術(shù)，外源性的線粒體通過增加肝細(xì)胞能量供應(yīng)，降低氧化應(yīng)激，緩解了APAP導(dǎo)致的肝臟損傷，但外源性的線粒體應(yīng)完整，損壞的線粒體可能會破壞肝細(xì)胞[36]。因此，外源性線粒體在細(xì)胞和動物水平緩解APAP所導(dǎo)致的肝損傷為治療因線粒體損傷導(dǎo)致的人肝損傷提供了一種有潛力的治療方案，但若進(jìn)入臨床治療，還有待深入。

3 結(jié)語

目前，APAP是造成藥物性肝損傷的主要因素，其致病過程較為復(fù)雜，且不同階段呈現(xiàn)出不同的特征。雖然臨床上認(rèn)為常規(guī)劑量的APAP副作用較少，但由于目前超過30種在售的解熱鎮(zhèn)痛藥都含有APAP[5]且患者對APAP肝毒性的認(rèn)識較少，易導(dǎo)致患者在無意識的情況下重復(fù)服用APAP，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟受損，因此在未來對APAP肝毒性的防治工作中不僅要加強(qiáng)對治療藥物和治療方案的研究與開發(fā)，還需提高患者對APAP肝毒性的認(rèn)識，才能從根源減少APAP導(dǎo)致的肝損傷。