劉晶，李福軍，馮琦，孫昕

河南科技大學第一附屬醫(yī)院1口腔科，2腫瘤科，河南 洛陽 471000

腫瘤干細胞和胚胎干細胞均具有維持細胞自我更新能力的特性，提示兩者之間可能存在某種相同的分子結構[1]。八聚體結合轉錄因子4（octamer binding transcription factor 4，Oct4）和性別決定區(qū)Y框蛋白2（sex determining region Y-box 2，SOX2）均屬于典型的胚胎干細胞轉錄因子和分子標志物。近年來，眾多學者還發(fā)現(xiàn)Oct4和SOX2在舌鱗狀細胞癌[2]、宮頸癌[3]等多種腫瘤組織中呈高表達，具有類似原癌基因的活性，通過影響組蛋白或DNA甲基化，調節(jié)染色質狀態(tài)和開放程度，從而實現(xiàn)誘導和維持腫瘤干細胞的多能性。此外還有學者提出，SOX2和Oct4可同時被某些相同的基因所調控。例如，Chen等[4]發(fā)現(xiàn)微小RNA（microRNA，miRNA）-221可同時抑制SOX2、Oct4在小鼠胚胎干細胞中的表達。而Fuchs等[5]則提出SOX2、Oct4在胚胎癌細胞中表達上調，并且受miRNA-27的負性調控。miRNA是一類廣泛存在于真核細胞中的非編碼小分子RNA，具有穩(wěn)定的保守序列，可作為口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）診療中的敏感分子標志物?；谏鲜隼碚摲治?，本研究通過檢測OSCC組織中miRNA-27、SOX2、Oct4的表達水平，并分析其與患者臨床特征及預后的關系，旨在為OSCC的臨床診斷和個體化治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年10月至2013年12月于河南科技大學第一附屬醫(yī)院就診并接受手術治療的OSCC患者。納入標準：①經病理檢查首次確診為原發(fā)性OSCC；②術前未進行放療、化療及其他抗腫瘤治療；③臨床和隨訪資料完整。排除標準：合并代謝系統(tǒng)疾病、急慢性感染、嚴重肝腎功能障礙、心腦血管疾病或其他可能干擾miRNA-27、Oct4、SOX2表達的疾病。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入116例OSCC患者，其中，男71例，女45例；年齡18～78歲，中位年齡為57歲，平均年齡為（54.31±16.17）歲；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（International Union Against Cancer，UICC）和美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）頒布的腫瘤TNM分期（第7版）標準[6]：Ⅰ期58例，Ⅱ期35例，Ⅲ期23例。另選取同期于河南科技大學第一附屬醫(yī)院接受手術治療的口腔良性疾病患者。納入標準：經手術確診為口腔良性疾病。排除標準：合并代謝系統(tǒng)疾病、急慢性感染、嚴重肝腎功能障礙、心腦血管疾病。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入40例口腔良性疾病患者，其中口腔白斑患者20例，口腔扁平苔蘚患者16例，單純舌肥大患者4例。40例口腔良性疾病患者中，男23例，女17例；年齡20～79歲，平均年齡為（53.35±15.80）歲。OSCC患者和口腔良性病變患者的性別、平均年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。收集116例OSCC患者的OSCC組織及40例口腔良性疾病患者的口腔良性病變組織。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol試劑盒、One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit均購自美國Invitrogen公司；mirPremier? microRNA Isolation Kit、SYBR Green PCR master Mix均購自日本Takara公司；兔抗人SOX2單克隆抗體、兔抗人Oct4多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-perosidase，SP）法試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。NanoDrop-1000分光光度計購自美國NanoDrop公司；iQ5 Real-time PCR System購自美國Bio-Rad公司；RM2135石蠟切片機購自德國Leica公司；Image Pro Plus圖像處理分析軟件購自美國Media Cybernetics公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織RNA提取 采用Trizol法提取各組織標本中的總RNA，并檢測260 nm和280 nm波長下的吸光度值（A）。當 A260/A280為 1.6～1.8時，說明RNA純度較高。

1.3.2 miRNA-27的相對表達量 以逆轉錄合成的反向轉錄DNA（cDNA）作為模板，以小分子U6作為內參進行實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）。冰浴中配制20μl PCR反應體系，反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)42次；60 ℃ 5 min終止反應。miRNA-27上游引物為5'-ACAGCTGCTCCAGTCCTGGTCA-3'，下游引物為5'-CTGGTGTCACTACATCTAAGAGTC-3'。根據(jù)使用說明調整基線，將閾值設定在熒光值對數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。

1.3.3 免疫組織化學染色法檢測Oct4和SOX2蛋白的表達情況 將組織切片逐步進行二甲苯脫蠟（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 min）和梯度乙醇水化（100%乙醇和95%乙醇各5 min），然后加入檸檬酸鈉緩沖液進行組織抗原修復，冷卻至室溫；滴加Oct4抗體或SOX2抗體（1∶100稀釋），4℃孵育過夜；滴加二抗，室溫下孵育1 h，洗滌；加入DAB（按照DAB顯色試劑盒說明書進行操作）染色5 min；脫水后，采用中性樹膠封片。室溫下干燥48 h后，由兩位以上病理科副主任醫(yī)師讀片并分析免疫組織化學染色結果。

1.4 結果判斷

1.4.1 miRNA-27表達情況 2-ΔΔCt＞中位值則為高表達，否則為低表達。

1.4.2 Oct4和SOX2蛋白表達情況 Oct4和SOX2蛋白陽性染色主要位于細胞質內，細胞質內有棕色或棕黃色顆粒為陽性表達，少數(shù)陽性染色細胞見于細胞核內。每張切片隨機取10個高倍視野（×400），每個視野分別計數(shù)100個細胞。依據(jù)陽性細胞所占百分比進行評分：＜5%為0分，≥5%為1分。依據(jù)染色強度進行評分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色或深褐色為2分。陽性細胞所占百分比評分與染色強度評分相乘，0分為陰性，1～2分為陽性。使用Image Pro Plus軟件對其進行定量分析，并記錄結果。

1.5 隨訪及療效評估

結合復診病歷，利用電話、電子通訊等手段對患者及其家屬進行隨訪，隨訪截至2018年12月30日?？偵鏁r間（overall survival，OS）為患者出院當日至隨訪截止時間或患者死亡時間。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗；采用Cox比例風險回歸模型對OSCC患者5年生存率的影響因素進行單因素和多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-27、Oct4蛋白、SOX2蛋白表達情況的比較

經實時定量PCR檢測，OSCC組織中miRNA-27的相對表達量為（0.283±0.076），明顯低于口腔良性病變組織的（0.455±0.072），差異有統(tǒng)計學意義（t=12.506，P＜0.01）。OSCC組織中Oct4蛋白、SOX2蛋白的陽性表達率分別為62.07%（72/116）、56.03%（65/116），均高于口腔良性病變組織的35.00%（14/40）、37.50%（15/40），差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=8.810、4.090，P＜0.05）。（圖1、圖2）

圖1 OSCC 組織和口腔良性病變組織中miRNA-27的表達情況

圖2 OSCC 組織和口腔良性病變組織中Oct4蛋白、SOX2蛋白的表達情況（免疫組織化學染色，×400）

2.2 不同臨床特征OSCC患者OSCC組織中miRNA-27、Oct4蛋白、SOX2蛋白表達情況的比較

OSCC患者OSCC組織中miRNA-27相對表達量的中位值為0.285，其中59例患者的miRNA-27相對表達量≤0.285，即呈低表達。不同吸煙史、分化程度、TNM分期、T分期、N分期的OSCC患者OSCC組織中miRNA-27的低表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=4.545、8.712、10.950、7.204、6.829，P＜0.05）。不同吸煙史、TNM分期、N分期的OSCC患者OSCC組織中Oct4蛋白的陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=14.941、14.908、5.047，P＜0.05）。不同TNM分期OSCC患者OSCC組織中SOX2蛋白的陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.305，P＜0.05）。而不同性別、年齡、腫瘤部位的OSCC患者OSCC組織中miRNA-27的低表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、T分期的OSCC患者OSCC組織中Oct4蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同性別、年齡、腫瘤部位、吸煙史、分化程度、T分期、N分期的OSCC患者OSCC組織中SOX2蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征OSCC患者OSCC組織中miRNA-27、Oct4蛋白、SOX2蛋白的表達情況（n=116）

2.3 miRNA-27、Oct4蛋白、SOX2蛋白表達情況與OSCC患者預后的關系

OSCC患者的隨訪時間為6～68個月，中位隨訪時間為62個月，無失訪病例。OSCC患者的5年生存率為62.93%（73/116）。Log-rank檢驗結果顯示，miRNA-27低表達患者的5年生存率明顯低于miRNA-27高表達患者，miRNA-27低表達+Oct4陽性表達+SOX2陽性表達患者的5年生存率明顯低于其他患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而不同Oct4蛋白及SOX2蛋白表達情況患者的5年生存率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 miRNA-27、Oct4蛋白、SOX2蛋白表達情況與OSCC患者預后的關系（n=116）

2.4 OSCC患者5年生存率影響因素的Cox比例風險回歸分析

以性別、年齡、腫瘤部位、吸煙史、分化程度、TNM分期、T分期、N分期、miRNA-27表達情況、Oct4蛋白表達情況、SOX2蛋白表達情況為自變量，以OSCC患者的5年生存率為因變量，采用Cox比例風險回歸模型進行單因素和多因素分析，結果顯示，有吸煙史、TNM分期為Ⅲ期、N分期為N2～3期均是OSCC患者5年生存率的獨立危險因素，而miRNA-27高表達是OSCC患者5年生存率的獨立保護因素（P＜0.05）。（表3）

表3 116例OSCC患者5年生存率影響因素的單因素和多因素分析

3 討論

相較于正常細胞，腫瘤干細胞起源于分化良好的體細胞的去分化，具有無限增殖能力和持續(xù)自我更新能力，這些特點與胚胎干細胞極其相似。因此有學者提出可以從胚胎干細胞角度尋找與腫瘤發(fā)生相關的靶分子[7]。Oct4和SOX2屬于典型的胚胎干細胞轉錄因子，同時也是維持干細胞多潛能性和自我更新的兩個關鍵核心調控因子[8]。通過形成Oct4-SOX2異二聚體復合物，結合胚胎干細胞關鍵因子NANOG及自身啟動子，或者與NANOG下游靶基因[如成纖維細胞生長因子4（fibroblast growth factor 4，F(xiàn)GF4）、未分化胚胎干細胞轉錄因子1（undifferentiated embryonic cell transcription factor 1，UTF1）等]的啟動子區(qū)域相結合，形成復雜的調控網(wǎng)絡。2005年，Taranger等[9]提出腫瘤干細胞與胚胎干細胞具有類似的分化特性。隨后，Saigusa等[10]也證實Oct4和SOX2不僅高表達于胚胎干細胞，同時在結腸癌組織中也呈高表達。Fu等[11]學者發(fā)現(xiàn)Oct4蛋白和SOX2蛋白在OSCC組織中的表達水平高于正?？谇火つそM織，這與本研究的結果基本一致。

口腔扁平苔蘚和口腔白斑屬于口腔癌前病變和癌前病損的典型疾病類型，但并非所有癌前病變患者均會進展為口腔癌，因此尋找敏感性較高的分子標志物用于篩選高危患者同樣具有重要的臨床意義。基于病理學分析，口腔扁平苔蘚患者多以固有層淋巴細胞浸潤及上皮基底細胞液化為主要特征，口腔白斑患者則主要表現(xiàn)為上皮過角化、不全角化和不典型增生；上述這些臨床特征均會導致口腔黏膜的潰瘍和糜爛。有學者曾提出，口腔黏膜上皮細胞對潰瘍和糜爛的修復正是依靠成體干細胞的自我更新和特異分化能力[12]。Adorno-Cruz等[13]學者認為口腔上皮內成體干細胞的這種修復作用引起的上皮細胞內重編程是口腔黏膜上皮癌變的主要誘因，而Oct4和SOX2在此過程中發(fā)揮著關鍵作用。基于上述理論分析，本研究對比了OSCC組織和口腔良性病變組織中Oct4和SOX2蛋白表達的差異，結果發(fā)現(xiàn)，OSCC組織中Oct4和SOX2蛋白的陽性表達率均高于口腔良性病變組織，并且本研究結果還表明，Oct4蛋白表達可能與吸煙史、TNM分期、N分期有關，而SOX2蛋白表達可能與TNM分期有關，但是兩者與OSCC患者預后的關系并不密切。

此外，miRNA也是調控腫瘤干細胞功能的關鍵因素。相對于腫瘤組織中的蛋白分子，miRNA的穩(wěn)定性更高、調控范圍更廣。在前期實驗中，作者通過檢索PubMed、TargetScan等數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，多種miRNA可結合于Oct4和SOX2基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'末端非編碼區(qū)，進而調控Oct4和SOX2基因的轉錄和翻譯。Chinnathambi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎干細胞中miRNA-145的表達量與Oct4的表達量呈負相關。Tabrizi等[15]研究證實，miRNA-302b通過上調“干性”標志物Oct4和SOX2的表達促進結腸癌細胞HT-29的增殖，從而維持結腸癌細胞的“干性”和多潛能性。Fuchs等[5]建立了Oct4基因和SOX2基因沉默的腫瘤細胞模型，結果提示miRNA-27與Oct4、SOX2的表達呈負相關?？紤]到miRNA表達變化是癌變發(fā)生的早期事件，因此本研究對miRNA-27的表達量進行分析，結果顯示，miRNA-27在OSCC組織中的相對表達量較低，且可能與吸煙史、分化程度、TNM分期、T分期、N分期及5年生存率有關。提示miRNA-27的表達水平與腫瘤干細胞的增殖、分化等生物學行為可能具有某種關聯(lián)，可靶向調控某些干細胞特異性標志基因（如Oct4和SOX2）對細胞形態(tài)學變化的誘導作用，從而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究的多因素分析結果顯示，有吸煙史、TNM分期為Ⅲ期、N分期為N2～3期均是OSCC患者5年生存率的獨立危險因素，而miRNA-27高表達是OSCC患者5年生存率的獨立保護因素。

綜上所述，OSCC組織中miRNA-27的相對表達量較低，而Oct4蛋白、SOX2蛋白的陽性表達率較高，三者之間可能具有某種調控關系。對于同時出現(xiàn)miRNA-27低表達且Oct4蛋白和SOX2蛋白均陽性表達的OSCC患者，建議臨床密切隨訪。