梁斯佳 毛基鍇 龔晨 于東冬 周建光

摘?要?樣品預處理是分析檢測的重要環(huán)節(jié)，尤其對于原始濃度低的樣品，預富集技術有利于提高分析方法的準確度，拓展應用范圍。但是，常規(guī)樣品預富集技術往往操作繁瑣，且依賴昂貴設備，檢測時間和成本隨之增加。紙基微流控樣品預富集技術具有易制備、低成本、高效率等優(yōu)點，簡化了操作過程，降低了檢測成本。本文重點介紹了近年來紙基微流控樣品預富集技術與應用的研究進展，包括富集原理、紙基材料選擇與裝置結構設計及應用，并對此技術的發(fā)展趨勢進行了展望。

關鍵詞?紙基微流控; 樣品預富集; 動電堆疊; 評述

1?引 言

樣品預處理在分析檢測中具有至關重要的作用。相比傳統(tǒng)實驗室檢測技術，現(xiàn)場快速檢測技術面對突發(fā)事件可進行快速應急檢測[1，2]，近年來已廣泛應用于臨床診斷[3～5]、食品安全[6～8]和環(huán)境監(jiān)測[9，10]等領域。然而，現(xiàn)場快速檢測所面對的樣品成分通常十分復雜，并且有效信息物含量較低，如不進行樣品預富集，常難以滿足檢測需求[11，12]。而傳統(tǒng)實驗室樣品預處理方式耗時較長，且依賴昂貴儀器設備[13，14]，不僅會增加分析檢測的成本，還會限制現(xiàn)場快檢技術在資源貧乏地區(qū)的應用。為解決上述問題，

研究者致力于易操作、低成本的樣品預富集技術的研究。紙基微流控樣品預富集技術以其易制備、易操作、低成本、高效率、便攜性強、環(huán)境友好、可降解等優(yōu)點成為該領域的研究熱點?；赪eb of Science的出版數(shù)據(jù)分析（圖1），紙基微流控樣品預處理的相關研究近年來發(fā)展迅速，自2010年以來文獻數(shù)呈逐年增多的趨勢。

紙基微流控技術以紙為基底，通過特殊加工，利用紙纖維形成的微通道完成微分析過程[15]。紙基材質成本低、親水性好，無外力驅動即可完成樣品的儲存、混合和流動，并且反應活性高，生物相容性好，相對固相微萃取的填料更易進行洗脫[16～18]。研究者充分利用紙基材料的優(yōu)質特性，結合多種富集原理，研發(fā)紙基微流控樣品預富集技術與裝置，不僅可滿足現(xiàn)場快速檢測的需求，還能作為其它先進的分析設備（如液相色譜或質譜）的離線樣品預處理裝置，縮短了分析時間，提高了檢測效率。本文介紹了紙基微流控樣品預富集原理，總結了紙基微流控樣品預富集技術近年來的研究成果，包括紙基材料的選擇與裝置的結構設計以及技術的新應用，最后對本研究領域的發(fā)展前景進行了展望。

2?紙基微流控樣品預富集原理

紙基微流控樣品預富集技術有效利用紙基材料的特有性質達到富集目的。紙基孔隙率高、孔徑小，可作為攔截吸附的材質; 紙纖維縱橫交錯所形成的三維網(wǎng)狀結構為液體提供了微通道，在無外驅動力時可依靠毛細作用力引導流動; 紙基的主要成分為纖維素，纖維素含有羥基和羧基等活性基團，因此可對紙基進行化學修飾，提高富集的選擇性; 紙基在電場作用下會產(chǎn)生電滲等動電效應，促進帶電分析物的動電堆疊[19，20]。紙基微流控樣品預富集原理主要有以下幾種：過濾吸附、尖端富集、雙相層析、蒸發(fā)濃縮、選擇性捕獲、靜電作用和動電堆疊。

2.1?過濾吸附

過濾吸附富集原理是利用紙基作為濾膜，在流體通道內吸附攔截分析物，提高單位體積內分析物的含量，該方法常需外界設備來提供輔助驅動力。Walsh等[21]為從大體積低濃度的樣本中富集目標細胞，外部搭載離心設備，采用離心力驅動樣品，用帶有一定弧度的紙基作為過濾吸附目標細胞的富集區(qū)。在離心力的作用下，樣品中的細胞向外擴散并被紙基條帶攔截，最終富集在紙基材料上，其濃度可滿足熒光檢測的要求。上述方法雖能處理大體積樣品，但需外部驅動，便攜性不強。Tang等[22]?將基于膜過濾的透析富集方法與免疫層析試紙條結合，采用玻璃纖維、半透膜和聚乙二醇溶液制作紙基樣品預濃縮裝置，富集10 min后，將免疫層析試紙條的進樣墊與含有試樣溶液的半透膜接觸，通過毛細作用力引入樣品產(chǎn)生比色信號。富集后，HIV病毒核酸和肌紅蛋白的檢測信號均明顯增強。該方法簡單、廉價且便攜性強。

2.2?尖端富集

尖端富集原理利用紙帶末端尖角的收斂作用結合層析過程，通過溶劑帶動分析物不斷涌向紙基頂端，使分析物最終匯聚在尖端形成高濃度富集區(qū)，Xu等[23]利用此原理（圖2A）對羅丹明6G和結晶紫進行富集，表面增強拉曼光譜（Surface-enhanced Raman Scattening，SERS）的檢出限分別可達1×1020 mol/L和1×1019 mol/L。 該富集方法雖然針對低濃度樣品富集效果好，但是耗時較長。

2.3?兩相層析

兩相層析富集原理是不同體積配比的兩相水體系（Aqueous two-phase systems，ATPS）[24]結合層析過程，最終因不相容而在紙基上分離，分析物會隨其中一相側流并富集在紙基的特定區(qū)域上。

Kamei課題組[25，26]利用3D紙墊進樣井結構將優(yōu)化后的兩相體系與免疫層析試紙條結合，使均相溶液在流經(jīng)紙基時可迅速分離成兩相，完成預富集過程（圖2B）。相比之前的雙相體系，大大縮短了時間，避免了預富集和檢測間的額外交互。該方法使針對轉鐵蛋白和瘧疾蛋白生物標志物的檢測靈敏度提高了10倍，并可處理血清樣本。這種紙基微流控樣品預富集技術縮短了檢測時間，減少了干擾，但需謹慎選擇兩相溶液。

2.4?蒸發(fā)濃縮

當樣本量大、濃度低時，通常采用蒸發(fā)紙基上的載液濃縮分析物。Wong等[27]采用局部加熱促進溶劑蒸發(fā)的方法處理百微升級樣品，從尿液中以20倍富集比提取結核病標志物（圖2C）。該方法要求分析物熱穩(wěn)定性好，且需要外接加熱設備。針對溶劑蒸發(fā)誘導的富集過程，Syms[28]結合毛細現(xiàn)象、層析過程、滲透蒸發(fā)等物理原理建立紙基蒸發(fā)預富集數(shù)學模型分析動態(tài)過程，通過實驗驗證理論推導，得出結論：紙基性質決定佩克雷系數(shù)，并影響富集效果，該過程不僅能富集分析物，還可實現(xiàn)多種分析物的分離。

另一種蒸發(fā)富集是利用咖啡環(huán)效應使分析物富集在咖啡環(huán)邊界處，從而完成定點檢測。Huang等[29]在室溫下干燥SERS紙基底上的羅丹明6G液滴，形成咖啡環(huán)，比較咖啡環(huán)上與咖啡環(huán)內的SERS信號強度（圖2D），發(fā)現(xiàn)分析物在咖啡環(huán)上的預富集效應對信號增強與復現(xiàn)性起關鍵作用，檢出限可達3.75 nmol/L。但是，咖啡環(huán)的形成會受多種因素影響，且可控性低。

2.5?選擇性捕獲

選擇性捕獲富集原理是在紙基上修飾一些可特異性結合分析物的物質，利用化學鍵、極性、靜電結合等作用力捕獲分析物造成堆疊，提高富集選擇性。如Byrnes等[30]在硝化纖維素和玻璃纖維制備的紙基上修飾一種通過靜電作用而對DNA具有捕獲效果的線性多糖殼聚糖。利用吸水襯底帶動含有DNA的樣品側流，流經(jīng)特定區(qū)域時，DNA與殼聚糖結合并停止流動，達到富集目的（圖2E）。該方法可通過控制調節(jié)pH值，使DNA從紙基富集區(qū)洗脫釋放。洗脫后的DNA濃度無需純化，可直接進入下游分析過程，進行擴增操作。

2.6?靜電作用

靜電作用富集是利用靜電力富集分析物，Abbas等[31]創(chuàng)新性地在SERS檢測紙基上修飾帶電聚合物，如帶正電的聚丙烯胺鹽酸鹽或帶負電的聚苯乙烯磺酸鈉，紙基被裁剪為帶有尖端的多角形狀，樣品滴加在紙基中心（圖2F）。當分析物電性與修飾的聚合電解質相同時，會在靜電斥力作用下富集在角狀分支的底部; 反之則會在靜電引力作用下富集在角狀分支的尖端。研究者還利用這種現(xiàn)象，完成了混合物的富集與分離。該富集方法對SERS檢測信號具有明顯增強作用，但無法應用于電中性物質。

2.7?動電堆疊

動電堆疊（Electrokinetic stacking，ES）利用電壓驅動帶電分析物，在多種動電效應下完成富集過程，常用于生物大分子（如蛋白質、核酸等）可帶電的分析物的富集分離。

紙基材料除了提供毛細管路也會引發(fā)電滲現(xiàn)象參與動電堆疊。利用動電堆疊進行樣品富集是近年紙基微流控樣品預富集的研究熱點。該類方法富集效率高、可控性強、耗時短，很大程度縮短了整個分析過程的時間。應用在紙基微流控樣品預富集的動電堆疊有以下幾種模式：等速電泳（Isotachophoresis，ITP）、等電聚焦（Isoelectric focusing，IEF）、場放大樣品堆疊（Field amplified sample stacking，F(xiàn)ASS）和離子濃差極化（Ion concentration polarization，ICP）。

2.7.1?ITP?等速電泳（ITP）是毛細管電泳常用的富集方法，也是較早在紙基微流控上成功實現(xiàn)的技術。ITP是一種不連續(xù)介質電泳技術，依靠各介質間離子淌度的差異完成樣品富集。分析物經(jīng)過電泳分離達到穩(wěn)定后，最終被壓縮為一個極窄的區(qū)帶，以達到富集目的，并可通過調控分析物前后介質的離子淌度控制富集效果[32，33]，原理如圖3A所示。

Moghadam 等[34，35]將ITP應用在紙基微流控上，通過降低表面蒸發(fā)與焦耳熱進行優(yōu)化，在短時間內高效富集，甚至可從100 μL的大體積樣品中萃取出60%的分析物。該裝置僅靠電池供電，具有較強的便攜性。此富集方法還可應用在免疫層析試紙條上，在90 s內完成免疫球蛋白的富集，并使比色法的檢出限改進兩個數(shù)量級。

2.7.2?IEF?等電聚焦（IEF）主要用于蛋白質的預濃縮。該方法是根據(jù)蛋白質分子等電點的不同，在一系列pH梯度中，蛋白質通過電場作用遷移到與其等電點相同的pH區(qū)域，此時蛋白質不再帶電，停止遷移，由此完成分離與富集[36，37]（圖3B）。Niu等[38]利用IEF原理，在紙基上完成了蛋白質富集與分離過程。利用紙基條帶形成IEF通道，侵潤羥乙基纖維素以避免快速蒸發(fā)。在紙帶上形成穩(wěn)定的pH梯度，并施加直流高壓進行富集操作。該紙基微流控預富集裝置可在6 min內完成對牛血紅蛋白的富集。當不同蛋白質的等電點差異高于0.03時，還可利用IEF在紙基上進行分離。該樣品預處理方法經(jīng)濟有效，在臨床疾病診斷和生物標志物分析方面具有潛在用途。

2.7.3?FASS?場放大樣品堆疊（FASS）是基于電場強度不同，引起分析物電泳速度的改變，從而堆疊富集在毛細管區(qū)帶電泳界面處[39，40]。該富集原理需要保證被富集物的電導率低于背景緩沖液（圖3C）。

Wu課題組[40～42]首次將場放大樣品堆疊引入紙基微流控，并產(chǎn)生反向電滲促進樣品富集，成功地在300 s內完成了的對熒光探針和雙鏈DNA的富集，并實現(xiàn)了3個數(shù)量級的信號增強 [40]。該課題組還驗證了背景緩沖液中陽陰離子與電解水中的OH/H+離子的酸堿滴定反應在富集過程中的重要作用[41]。

2.7.4?ICP?離子濃度極化（ICP）是動電堆疊領域近年來的研究熱點，具有操作容易、結構簡單、成本低且富集倍數(shù)高的優(yōu)點，在2～10 min內可富集102～103倍。ICP富集的原理如圖3D所示，在外部施加電壓時，具有離子選擇性的膜會使其表面附近的電解液中離子濃度產(chǎn)生變化，膜一側濃度降低形成耗盡區(qū)，造成通道內電場分布不均，最終導致帶電分析物在不同位置遷移速度不同。在電滲和電泳的作用下，分析物運動最終達到平衡并堆積在耗盡區(qū)邊緣形成富集[43～45]。

Sinton課題組[44～46]最早將ICP富集方法應用在紙基微流控上，利用蠟打印法制備紙基微流控預富集芯片，將離子選擇性透過材料噴涂在紙基微流控預富集芯片的特定區(qū)域。該芯片針對熒光探針的富集可達40倍，對蛋白質、色素的富集可有效改善檢出限，而單片紙基微流控預富集芯片成本僅0.015美元。

3?預富集裝置中紙基的選擇與結構設計

3.1?紙基的選擇

紙基材料成本低、易制備、易折疊、結構疏松多孔且比表面積大，在無需外驅動的情況下，即可引導液體流動，同時又具有一定的反應活性，這些良好的特性使其成為分析檢測及樣品預富集的理想平臺。傳統(tǒng)意義的紙基材料是指由纖維素構成，通過浸潤、烘干、壓膜成型等一系列造紙技術制備的材料。隨著材料科學中柔性基材的發(fā)展，研究者對“紙基”的定義不再局限于傳統(tǒng)意義的紙基材料，已擴展至具有適當柔性或多孔結構的紙和膜。具有優(yōu)異特性的新型膜材料已在微流控等眾多研究領域中引起廣泛關注[47]。在紙基微流控樣品預富集裝置中，常用的材料包括濾紙、硝化纖維素膜、玻璃纖維素紙、醋酸纖維素膜等。

通常根據(jù)被分析物和富集原理選取紙基材料，以保證有效富集。其中較為常用的是Whatman系列濾紙，該濾紙吸水性強，層析速度適中，價格低廉。如針對生物大分子進行富集檢測，會選用生物兼容性較好、對生物分子結合能力強的硝化纖維素膜，該材質已廣泛應用于制備免疫層析試紙條。商品化的硝化纖維素膜的結構和孔隙度可控，比色分析對比度高，已經(jīng)被驗證為動電堆疊的良好基材。玻璃纖維素紙則具有生物兼容性好、毛細管結構優(yōu)良、耐燃性好、潤濕性好、電滲透性能好等優(yōu)點，常在動電堆疊和兩相層析中被選為基材。有時為了減少對蛋白質的吸附，會采用醋酸纖維素膜作為基材。

3.2?結構設計與優(yōu)化

根據(jù)不同的富集原理，紙基微流控樣品預富集分析裝置的結構設計也各有不同。采用紙基作為濾膜進行過濾吸附富集時，需考慮適配外界驅動設備。當利用離心力驅動液體樣品[21]，通常將一定弧度的紙基通過壓敏膠帶圍成樣品通路，夾在兩層塑料圓盤中，圓盤中心流入樣品（圖4A）。當用蠕動泵驅動液體時[48]，可將微型離心管蓋子打孔，作為過濾吸附濾紙的支架和進樣管通過塞子連接（圖4B）。為了利用紙基尖端的收斂作用，尖端富集的紙基微流控裝置常采用一端尖角的結構[23]。

近年來，紙基動電堆疊樣品預富集引起研究者的關注?；A的紙基動電堆疊裝置通常采用單通道連接雙儲液池的結構。然而，此類結構易受焦耳熱影響，引發(fā)底液蒸發(fā)，甚至紙基燒灼。高效率與焦耳熱間的綜合考量成為結構優(yōu)化的一個方向。為了減少焦耳熱的產(chǎn)生，Bercovici課題組[49～51]利用數(shù)學建模與仿真對紙基上的ITP富集過程進行分析，最終通過降低紙基通道深度，使大電場與焦耳熱間達到平衡（圖4C）。該課題組還研究了電滲和ITP富集的之間的平衡模型，發(fā)現(xiàn)當分析物帶負電時，可利用紙基的電滲作用縮短通道長度，同時，采用圓弧形電極代替直線電極進行優(yōu)化，經(jīng)驗證優(yōu)化結構后，富集效果明顯提升。Yang的課題組[52～54]在ICP紙基微流控預富集芯片上引入多通道結構，實驗結果表明，多通道結構收斂作用和匯集處的流動聚焦效應會促進樣品的富集。該小組還通過雙面蠟打印將紙基通道深度控制在50 μm，以此降低電滲速度與電壓需求，改善富集效果（圖4D）。

與2D紙基芯片相比，折疊式3D紙基芯片流速快，儲液能力強，每層都可實現(xiàn)不同功能，這些優(yōu)勢為動電堆疊紙基微流控預富集芯片的設計提供了新思路。Li等[55]用折疊結構設計了一款基于ITP原理的紙基微流控預富集芯片，便于對富集后的樣本進行回收和分析（圖4E）。 Chou等[56]采用折疊結構增大了儲液體積，并對離子選擇性透過膜覆蓋面積加以控制，減少樣品損耗，降低電壓需求（圖4F）。Lee等[57]構建了折疊結構的ICP紙基微流控預富集芯片，通過折疊將進樣區(qū)和富集區(qū)聯(lián)通，富集后可減掉進樣區(qū)，只保留富集區(qū)進行下一級檢測。

研究者采用多種策略對ICP紙基微流控預富集芯片進行簡化制備，有的甚至可省略蠟打印步驟和選擇性透過膜的噴涂過程。Lee課題組[58，59]通過將蠟打印的紙基底與印有特定形狀離子選擇性透過膜的膠帶粘和，制備ICP紙基微流控預富集芯片 （圖4G）。他們還將離子選擇性透過膜獨立出來，嵌套在市售的免疫層析試紙條上，以提高檢測靈敏度（圖4H）[60]。Phan等[61]將裁剪好的紙基、鉑電極與離子選擇性透過膜貼合，并層壓在有兩個儲液池開放口的塑料片上，制備一種不需要蠟打印的ICP紙基微流控預富集芯片; 利用Parafilm封口膜，只通過裁剪的方式制備ICP紙基微流控預富集芯片?（圖4I）[62]，該方法增加了芯片的機械強度，相比開放式的芯片具有更好的富集效率，降低樣品污染與表面樣品蒸發(fā)。這種簡單易操作的制備方法在大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)方面具有潛在的應用前景。

4?紙基微流控樣品預富集技術的應用

在常規(guī)實驗室的分析檢測中，紙基微流控樣品預富集技術可作為一些分析設備的快速、低成本的離線樣品預處理方法[42]。Niu等[38]采用紙基等電聚焦IEF預富集裝置處理的蛋白質，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜進行了檢測，結果表明，通過這種離線樣品前處理后，復雜樣品內含量極低的生物標志物可通過質譜進行高靈敏、高識別性的分析。近年來，基于紙基材料制備的SERS基底備受關注，研究者將紙基微流控樣品預富集技術集成在SERS檢測紙基底上，不僅可提高檢測靈敏度，還在很大程度上改善了SERS檢測的重現(xiàn)性[23，29，31]。

除了應用于常規(guī)實驗室的分析檢測，紙基微流控樣品預富集技術作為一種經(jīng)濟、簡單、便攜的預處理技術，更適用于現(xiàn)場快速檢測。如在環(huán)境監(jiān)測領域，為了檢測水中重金屬的含量，Satarpai等[48]利用化學修飾后的紙基高選擇性富集水中的Pb2+，隨后將富集后的紙基作為進樣端接入紙基芯片中進行比色檢測，使水中Pb2+的檢出限降低至μg/L級。Ouyang等[63]利用FASS富集原理，在6通道的紙芯片上并行分離和富集多個樣品，結合顯色反應，可高通量檢測多種重金屬離子，顯著改善了檢出限。在臨床診斷中，紙基微流控樣品預富集技術常用于核酸及蛋白質的檢測分析。Tiwari等[64]在紙基上原位合成棒狀ZnO納米粒子，由于該納米粒子具有很高的縱橫比和表面覆蓋率，為蛋白質的結合提供了更大的有效面積。結合蛋白質的酶聯(lián)免疫吸附測定，修飾ZnO納米粒子的紙基對肌紅蛋白的富集可達3倍。 Gong等[45]利用ICP紙基微流控預富集芯片直接進行DNA分析，在10 min內完成乙肝病毒靶點DNA的富集、分離與檢測; 之后，利用該芯片對精子染色質的完整性進行了檢測[46]，定量分析了精子DNA碎片率和包裝質量，該研究結果與臨床診斷標準的結果相同，并且結構簡單、成本低，分析快速靈敏。在食品安全領域，Wu等[42]利用FASS富集原理，制備出集成了樣品富集與分離的紙基微流控分析裝置，便攜性好、速度快，適用于小分子食品染料和大分子蛋白質的富集。除上述應用外，Ma等[65]以織物纖維為基底，采用ICP技術開展了海水淡化的應用研究，該技術僅需施加15 V電壓即可去除50 mmol/L NaCl溶液中85%的鹽分，可用于在偏遠或欠發(fā)達地區(qū)海水淡化。

基于智能手機的便攜式現(xiàn)場快速檢測裝置已經(jīng)成為紙基微流控樣品預富集技術應用領域的重要發(fā)展方向（圖5A），這類裝置由紙基微流控樣品預富集芯片、智能移動終端和外設硬件構成，其中智能移動終端具有控制計算、數(shù)據(jù)處理、人機交互等功能，并且可利用手機攝像頭拍攝光學信號; 外設硬件可提供分析檢測所需的光學通路與電學結構等。這類裝置便攜性強、成本低，是資源貧乏地區(qū)理想的現(xiàn)場檢測平臺。Wu課題組以FASS紙基微流控預富集芯片為核心集成了一種便攜式熒光增白劑的定量檢測裝置[66]，成像檢測系統(tǒng)由LED、光學顯微鏡片和智能手機固定集成，成功用于餐巾樣品中熒光增白劑的快速測定（圖5B）。該課題組通過引入其它光學檢測元件提高靈敏度和線性范圍，以實時監(jiān)測比色反應。新集成的檢測裝置可完成唾液或水樣本中亞硝酸鹽的檢測以及重金屬離子的檢測[67，68]。該課題組還研究了多種離子選擇性透過膜的 ICP效應[69]，擴展了ICP紙基微流控預富集的應用，搭載LED和智能手機構建熒光圖像檢測系統(tǒng)。Li等[70]將ICP紙基微流控預富集芯片適配智能手機。利用智能手機的攝像頭拍攝熒光圖像，并開發(fā)圖像處理專用應用程序，對熒光信號強度進行定量分析（圖5C）。

5?總結與展望

本文介紹了近年來紙基微流控樣品預富集方面的研究進展，包括富集原理、預富集裝置中紙基選擇與結構設計及相關應用。這項富集技術不僅可應用于常規(guī)實驗室的分析檢測，還可用于現(xiàn)場分析檢測，降低檢出限，提高靈敏度，拓寬了現(xiàn)場快速檢測技術的應用領域。研究者通過優(yōu)化結構、簡化制備方法、積極擴展與其它檢測平臺的聯(lián)用等多種方式不斷完善紙基微流控樣品預富集技術。紙基微流控樣品預富集技術搭載智能手機構建便攜式現(xiàn)場快速檢測裝置已經(jīng)成為重要的發(fā)展趨勢，是社區(qū)醫(yī)療、食品安全、環(huán)境監(jiān)測以及資源貧乏環(huán)境下進行現(xiàn)場檢測的理想平臺。

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