趙振霞 董華君 于強(qiáng) 陳新 蹇露

(1.山東省聊城市第二人民醫(yī)院整形外科，山東 聊城 252600；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院病理科，湖北 十堰 442000)

皮膚黑色素瘤(Cutaneous melanoma，CM)是一種極具侵襲性的癌癥，生存率低，死亡率高[1-3]。早期手術(shù)切除以及放化療為主的綜合治療是臨床中CM的主要治療方案，但CM極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后通常較差；且化療藥物對(duì)絕大多數(shù)CM患者沒(méi)有療效或表現(xiàn)出腫瘤耐藥性，這使得治療無(wú)效。近年來(lái)分子生物學(xué)和腫瘤表觀遺傳學(xué)的深入研究，研究者提出腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)；各種基因的異常表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞逃避正常機(jī)體生理調(diào)控功能，出現(xiàn)增殖異常和凋亡失控等現(xiàn)象。因此臨床中尋找早期診斷與判斷CM預(yù)后的靶點(diǎn)具有重要意義。sFRP-2是WNT信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，是一種分泌性糖蛋白，作為一個(gè)負(fù)調(diào)控因子參與多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞免疫、干細(xì)胞分化等[4-5]。已有文獻(xiàn)報(bào)道在包括頭頸部腫瘤、前列腺癌等腫瘤中具有重要的抑癌作用[6-7]。但對(duì)其參與CM的研究的甚少。本研究旨在評(píng)估sFRP-2對(duì)CM侵襲和轉(zhuǎn)移的功能和分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1試劑、材料儀器 胎牛血清和RAPI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司；Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞、293T 細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司; Lipofectamine 3 000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;慢病毒質(zhì)粒載體pLVX-IRES-ZsGreen1 購(gòu)自美國(guó)ProliantProliant公司；質(zhì)粒載體sFRP-2、質(zhì)粒載體包裝質(zhì)粒購(gòu)自上海碧云天實(shí)驗(yàn)公司; CCK-8 試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)實(shí)驗(yàn)公司。實(shí)驗(yàn)用一抗、二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。sFRP-2 基因引物由廣州復(fù)能基因公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2細(xì)胞系和臨床組織樣本 黑色素瘤細(xì)胞系(HM、A375、WM451和SK-MEL-1)購(gòu)自上海生科院細(xì)胞庫(kù)；對(duì)2005年1月至2018年12月于本院收治并由兩名以上病理科高年資醫(yī)師確診的并收治的共80例CM患者的臨床病例樣本。在這些患者中男49例以及女31名。年齡范圍在29～76歲之間，中位年齡49.7歲。所有病人臨床分期依據(jù)第8版AJCC版TNM分期，其中Ⅰ期13例、Ⅱ期22例、Ⅲ期28例及Ⅳ期17例。在2005～2018年的持續(xù)隨訪過(guò)程中共死亡56例，存活24例。本研究得到了我醫(yī)院的倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，組織標(biāo)本診斷由我院病理科高年制醫(yī)師診斷。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞和組織RNA和蛋白提取 CM細(xì)胞和組織的RNA和蛋白以及上述臨床樣本中RNA和蛋白提取步驟同已有的文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]。提取后RNA在Landdrop儀器中測(cè)得濃度，通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，實(shí)驗(yàn)方法及步驟參考樣品實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)及已有的參考文獻(xiàn)[10]。將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA放于-20 ℃冰箱中保存。

1.3.2sFRP-2過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建和細(xì)胞感染 慢病毒感染方法和步驟同參考文獻(xiàn)[11-12]。取細(xì)胞狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);參照Lipofectamine 3 000使用說(shuō)明，將包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8h更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后；收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，進(jìn)行細(xì)胞感染。慢病毒感染方法：取活性狀態(tài)下A375細(xì)胞，將慢病毒上清液置于A375細(xì)胞中共培養(yǎng)約6～8 h，更換完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。

1.3.3免疫組化實(shí)驗(yàn) 免疫組化方法和步驟同參考文獻(xiàn)[13]，主要包括了：組織切片脫蠟(3 μm，60 ℃，2 h)、脫缸(10 min/次)、抗原修復(fù)[熱誘導(dǎo)抗原表位修復(fù)、檸檬酸鹽緩沖液(pH=6)，30 min]、H2O2室溫下封閉(室溫下2h)、孵一抗(4 ℃凍庫(kù)，12 h)和二抗(37 ℃，2 h)、DAB顯色(室溫下5 min)、染核(蘇木紫及伊紅復(fù)染，室溫下5 min)、封片鏡檢等。在倒置顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野，計(jì)算相對(duì)光密度。選用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。根據(jù)病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：獨(dú)立評(píng)估陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量(范圍：0%～100%)和染色強(qiáng)度(范圍：0～3分：0分=無(wú)染色，1分=弱染色，2分=中度染色，3分=強(qiáng)染色)。

1.3.4qRT-PCR檢測(cè)sFRP-2在組織表達(dá) qRT-PCR的步驟同試劑盒使用說(shuō)明書(shū)和文獻(xiàn)所述[14-15]。sFRP-2-F：5’-CGTCAGAAGAAGCTGCTGCTCC-3’，sFRP-4-R：5’-TAATGGTCTCCACAGCACTCATA-3’。使用HT7500生物系統(tǒng)以及SYBRGreen的試劑盒。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增，選擇β-actin為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)；用2-△△Ct法對(duì)樣本基因進(jìn)行表達(dá)差異相對(duì)定量分析，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量，擴(kuò)增指數(shù)越高，相對(duì)表達(dá)越高。

1.3.5細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞處理同前，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行消化，按每孔3 000 個(gè)細(xì)胞接種96孔板，完全培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁后，實(shí)驗(yàn)前3 h在各孔中分別加入20 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)0、24、48和72 h時(shí)分別檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)480 nm 處檢測(cè)各孔的D值，根據(jù)D480 nm值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.6軟瓊脂平板克隆實(shí)驗(yàn) 軟瓊脂平板克隆實(shí)驗(yàn)方法和步驟同參考文獻(xiàn)[15]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，消化、離心、計(jì)數(shù)；將細(xì)胞稀釋成1×103細(xì)胞/mL備用。蒸餾水分別制備出1.3%和0.8%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液。分別使用1∶1比例將瓊脂糖液與1 640完全培養(yǎng)液混合后，平鋪于平皿中自然冷卻凝固形成雙側(cè)瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置于細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)約兩周；觀察克隆形態(tài)并計(jì)數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各重復(fù)三次。

1.3.7免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) A375在細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)：收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，提取細(xì)胞蛋白后測(cè)定蛋白濃度[16]。取50 μg/孔細(xì)胞蛋白進(jìn)行凝膠電泳，常溫下將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上，5%脫脂牛奶的TBST室溫下封閉2 h，加入一抗及內(nèi)參GAPDH(美國(guó)Abcam公司)，4 ℃凍庫(kù)封閉過(guò)夜。24 h后常溫下復(fù)溫約30 min，TBST液洗膜后，二抗封閉液室溫下?lián)u床孵育2 h，顯色劑(DAB)顯色、成像儀曝光，并用Quantity One軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH之比來(lái)表示相對(duì)表達(dá)差異。

2 結(jié) 果

2.1sFRP-2 mRNA在黑色素瘤細(xì)胞系和組織中的表達(dá) qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常色素痣相比，sFRP-2 mRNA在黑色素瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)(圖1A，P<0.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，sFRP-2 mRNA在黑色素瘤組織中表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B，P<0.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

(A)qRT-PCR顯示：與色素痣相比，sFRP-2 mRNA在黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)；***P<0.001.(B)qRT-PCR顯示：與癌旁組織相比，sFRP-2 mRNA在黑色素瘤組織中低表達(dá)，P<0.001。

圖1sFRP-2 mRNA 的表達(dá)

2.2sFRP-2 蛋白在黑色素瘤組織中的表達(dá) 通過(guò)免疫組織化學(xué)分析80例黑色素瘤組織和色素痣的蛋白相對(duì)表達(dá)；結(jié)果顯示：與色素痣相比，sFRP-2 蛋白在黑色素瘤組織中表達(dá)下調(diào)(圖2A)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)IPP 6.0軟件分析 sFRP-2 蛋白表達(dá)光密度顯示，與色素痣組織相比(0.324±0.012)，sFRP-2 在黑色素瘤中光密度降低(0.123±0.034)(圖2B，t=15.34，P<0.01)。

(A)與正常色素痣相比，sFRP-2 蛋白在黑色素瘤中表達(dá)下調(diào)；(B)光密度分析：sFRP-2 蛋白在黑色素瘤中表達(dá)下調(diào)，P<0.01。

圖2sFRP-2 蛋白在黑色素瘤中的表達(dá)

2.3sFRP-2蛋白表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系 sFRP-2 的表達(dá)與不同性別、不同年齡的基線特征無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著病理分級(jí)增加，sFRP-2 蛋白在黑色素瘤組織中陽(yáng)性率逐步降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)。見(jiàn)表1。

表1 臨床特征與 sFRP-2 蛋白表達(dá)的關(guān)系

2.4sFRP-2表達(dá)對(duì)患者生存時(shí)間的影響 sFRP-2 高表達(dá)患者中位生存時(shí)間為 56.12 個(gè)月，其三年存活率為56.78%; sFRP-2 低表達(dá)患者中位生存時(shí)間為 26.62 個(gè)月，其三年存活率為22.19%。Log-Rank 檢驗(yàn)結(jié)果提示 sFRP-2 高表達(dá)患者與 sFRP-2 低表達(dá)患者生存時(shí)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 sFRP-2 蛋白的表達(dá)情況與K-M 生存曲線

2.5sFRP-2 基因過(guò)表達(dá)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響 我們對(duì)黑色素瘤細(xì)胞 A375 進(jìn)行 sFRP-2 基因過(guò)表達(dá)，免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了sFRP-2的過(guò)表達(dá)(圖4A)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組 A375 細(xì)胞感染sFRP-2后細(xì)胞存活率顯著下降(圖4B，P<0.01)；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組 A375 細(xì)胞克隆形成的效率顯著下降(圖4C，P<0.001)。

(A)免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證sFRP-2在A375中的過(guò)表達(dá)；(B)CCK-8實(shí)驗(yàn)sFRP-2抑制細(xì)胞活性，P<0.01；(C)軟瓊脂平板克隆顯示sFRP-2 在抑制細(xì)胞克隆的形成，***P<0.001。

圖4sFRP-2表達(dá)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞A375增殖的影響

2.6過(guò)表達(dá)sFRP-2對(duì) Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的影響 通過(guò)免疫蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)過(guò)表達(dá) sFRP-2 后對(duì)active-β-catenin及下游靶基因的影響，結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá) sFRP-2 后，active-β-catenin及下游靶基因c-Myc、cyclinD1的表達(dá)明顯受到抑制；同時(shí)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21 和 p27等表達(dá)上調(diào)(圖5A，5B，P<0.001)。

(A)免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)分析過(guò)表達(dá)sFRP-2對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響；(B)灰度定量分析過(guò)表達(dá)sFRP-2對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)的影響，兩組比較，***P<0.001。

圖5sFRP-2 過(guò)表達(dá)后對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

3 討 論

黑色素瘤的發(fā)病率在皮膚腫瘤中僅次于鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌，是最常見(jiàn)的三種皮膚癌的類型之一。其具有高度轉(zhuǎn)移潛能，能在淋巴結(jié)、肝、肺和腦等部位發(fā)生轉(zhuǎn)移；是目前死亡率最高的皮膚腫瘤。盡管發(fā)病率不高，但世界范圍內(nèi)患有黑色素瘤的人數(shù)不斷增加，且黑色素瘤患者的預(yù)后仍不理想，平均生存期不到6個(gè)月。針對(duì)黑色素瘤的治療方法取得了巨大的發(fā)展：包括達(dá)巴芬尼、維穆拉芬尼和曲美替尼等激酶抑制劑用于BRAF V600E突變患者，單克隆抗體，PD-1的免疫治療等[17]。但黑色素瘤患者的預(yù)后和生存率仍然不佳。因此，迫切需要尋找早期預(yù)測(cè)黑色素瘤發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的治療靶點(diǎn)。

Wnt 信號(hào)調(diào)節(jié)因子 sFRPs 因其在腫瘤中的作用而備受關(guān)注。作為sFRPs家族成員之一，sFRP-2作為一種抑制基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。文獻(xiàn)報(bào)道[18]， sFRP-4在頭頸部/口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)；高表達(dá)的sFRP-4在頭頸部/口腔鱗狀細(xì)胞癌容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且預(yù)后較差。sFRP-5在黑色素瘤中低表達(dá)，sFRP-5 的表達(dá)可能在黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮潛在的作用，并作為人類黑色素瘤治療的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)[18]。但 sFRP-2表達(dá)對(duì)黑色素瘤的影響尚未見(jiàn)報(bào)道和研究。

本研究首先通過(guò)qRT-PCR 和免疫組化法分別檢測(cè)了 sFRP-2 在黑色素瘤細(xì)胞系和組織中相對(duì)表達(dá)，結(jié)果顯示：sFRP-2 在黑色素瘤細(xì)胞和組織中的表達(dá)下調(diào)，并可能在黑色素瘤進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，我們采用慢病毒轉(zhuǎn)移來(lái)過(guò)表達(dá) sFRP-2，通過(guò)CCK-8和軟瓊脂平板克隆實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 sFRP-2對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的直接生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果表明，sFRP-2 的過(guò)度表達(dá)能明顯抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性。同時(shí)，對(duì) sFRP-2 表達(dá)的臨床病理特征進(jìn)行了進(jìn)一步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在排除了性別、年齡與 sFRP-2 表達(dá)可能存在的相關(guān)性的情況下，sFRP-2 表達(dá)可能與黑色素瘤的生存有密切的關(guān)聯(lián)。有研究認(rèn)為在一些腫瘤中 sFRP-2 高表達(dá)能增加患者的生存期，本本研究得到了相似的結(jié)論。文獻(xiàn)研究顯示，sFRPs 家族對(duì)多種腫瘤的Wnt信號(hào)都有拮抗作用，我們通過(guò) Western blot 分析檢測(cè)了 A375 細(xì)胞中 Wnt 信號(hào)通路的蛋白表達(dá)水平，以探討 sFRP-2 抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。結(jié)果顯示sFRP-2 的過(guò)表達(dá)下調(diào)了 Wnt/β-catenin 及相關(guān)通路中關(guān)鍵因子的蛋白表達(dá)，表明 sFRP-2 抑制了典型 Wnt 信號(hào)。

綜述，本課題研究顯示 sFRP-2 基因在黑色素瘤組織中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá) sFRP-2 基因后能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin來(lái)調(diào)控黑色素瘤的進(jìn)展；可能作為重要的腫瘤性基因參與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展。