張金鳳 馬 雪 李 楊 柴云雷 馬麗媛 張雅娜

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院 黑龍江綏化 152061）

山藥又稱薯蕷、土薯、山薯蕷、懷山藥、淮山、白山藥，一年或多年生蔓生草本植物。山藥根莖肉質(zhì)潔白，營養(yǎng)豐富，兼食、藥為一體[1,44]。除含淀粉、黏液多糖、皂苷、黃酮、色素多酚類物質(zhì)、植酸、山藥堿、8大必須氨基酸等成分外，還含有鐵、磷、鈣等多種無機元素[2-3]，具有補脾養(yǎng)胃、補肺益腎的功效，可用于治療脾虛久瀉、慢性腸炎、慢性胃炎、肺虛咳喘、糖尿病、遺精和遺尿滯下等癥[4]。黃酮是一類以苯色酮環(huán)為基礎(chǔ)的酚類化合物，多為結(jié)晶性固體，溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)不同而有很大差異。黃酮具有抗氧化、改善血液循環(huán)、降低膽固醇、抑制炎性生物酶滲出等作用。

目前，提取山藥中總黃酮的相關(guān)研究較多，孫亞琴[6]利用雙水相提取山藥總黃酮，研究表明，60℃時用PEG-磷酸氫二鉀提取山藥總黃酮的效果相對較好。周厚良[7]利用熱浸提法提取山藥中黃酮進行工藝優(yōu)化，結(jié)果表明體積分數(shù)為70%，料液比為1：20，50℃提取120min 時提取率相對較高。徐東生[8]采用微波法提取山藥中的黃酮，研究最佳提取條件。但對于作為廢料丟棄的山藥皮研究的較少，僅趙立庭[9]和劉青[10]分別采用回流和索氏提取進行山藥皮中黃酮的提取，然而回流和索氏提取一般耗時間比較長，故從整合資源限度最大利用及生產(chǎn)效率等角度考慮，本文以山藥皮為原料采用超聲波輔助乙醇提取總黃酮，在提高生產(chǎn)效率的同時提高山藥本身經(jīng)濟價值，為其綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料與設(shè)備。山藥：綏化市售；蘆丁標品：中國藥品生物制品鑒定所；亞硝酸鈉、無水乙醇、石油醚、硝酸鋁和氫氧化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

721型分光光度計，上海元析儀器有限責(zé)任公司；電熱恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司；萬能粉碎機，天津市泰斯樂儀器有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

（二）實驗方法。

1.山藥皮中黃酮的提取。稱取一定量的山藥，洗凈，剔皮，放入平面皿在干燥箱中60℃烘干，待冷卻，用粉碎機粉碎干燥的山藥皮碎片過50目篩。準確稱取5g山藥皮粉，加入50mL95%乙醇浸泡2h，再用超聲波提取30min，抽濾，濾液用等體積的石油醚脫脂，再將濾液再進行濃縮至10mL，放置100mL 容量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，得總黃酮樣品液[1，44]。

2.蘆丁標準曲線制作。分別吸取質(zhì)量濃度為0.1mg/ml的蘆丁標準對照液 0.0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL，3.0mL、4.0mL，5mL置于10ml容量瓶中，分別加入0.3mL亞硝酸鈉溶液（5%），充分搖勻，放置6min；再加入0.3mL 硝酸鋁溶液（10%），充分搖勻，放置6min，再加入4.0mL 氫氧化鈉溶液（4%），用80%乙醇定容至刻度，充分搖勻后，放置12min，以無蘆丁対照液所在的容量瓶為空白對照，510nm波長處測其吸光度（A）。以蘆丁濃度為橫坐標，以吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線[11]。

3.樣品溶液含量測定。取待測樣液1mL放置于10mL容量瓶中，按2中標準曲線配制方法測定吸光度,并通過標準曲線回歸方程得出樣品液濃度,計算提取率。

式中：C 根據(jù)蘆丁標準曲線計算樣品中黃酮的含量，單位mg；

N為稀釋倍數(shù)；

V為待測液體積，單位mL；

M為樣品山藥皮質(zhì)量，單位g。

4.單因素試驗。以總黃酮提取率為指標，分別選取乙醇的體積、超聲功率、料液比及超聲時間作為單因素，進行試驗。從中選取適宜的條件，進行下一步正交試驗。

5.響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件。根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實驗設(shè)計原理，在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分數(shù)（A）、超聲功率（B）、料液比（C）和超聲時間（D）為響應(yīng)因素編碼水平為-1、0、1，山藥皮中總黃酮的提取率（Y）為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進行實驗設(shè)計。設(shè)計的因素水平表，如表1所示。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表

二、結(jié)果與分析

（一）標準曲線的繪制。根據(jù)方法2測定吸光值，繪制標準曲線，見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

（二）乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響。稱取6 組各5g 干燥山藥粉，在超聲波功率為300W，料液比為1：50 條件下，分別加入體積分數(shù)為40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇浸泡2h，超聲處理20min。乙醇體積分數(shù)對山藥皮中總黃酮提取率影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響

由圖2可知，乙醇體積分數(shù)從40%升高到70%山藥皮中總黃酮提取率增加，在乙醇體積分數(shù)為70%時，總黃酮提取率最大為0.366%，超過70%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，總黃酮提取率急劇下降，可能原因是提取過程中，乙醇濃度加大，提取溶液中低極性雜質(zhì)在提取溶劑中的含量不斷增加，導(dǎo)致溶液粘度增加，同時阻礙了黃酮類化合物的溶出，導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)提取量降低。同時使黃酮穩(wěn)定性被破壞[8]。所以由圖2綜合分析考慮，選擇乙醇體積分數(shù)為70%較佳。

（三）超聲波功率對總黃酮提取率的影響。稱取6 組各5g干燥山藥粉，在乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1：50，超聲波功率分別為100W，150W，200W，250W，300W，350W 條件下，先將6組樣品乙醇浸泡2h，再在超聲波處理20min，超聲波功率對山藥皮中總黃酮提取率影響見圖3。

圖3 超聲波功率對總黃酮提取率的影響

由圖3 可以看出，隨著超聲波功率的增加，總黃酮的提取率也逐漸增加，并在300W 時達到最大，之后出現(xiàn)下降趨勢，總黃酮提取率之所以隨著超聲波功率的增加而提高，是由于當超聲波在溶劑中傳播時，產(chǎn)生強烈的剪切力，引起了山藥組織細微裂縫的形成。超聲波功率越大，超聲波在提取介質(zhì)中的振幅越大，剪切破碎越劇烈有效成分的提取率越高。而超聲波功率大到一定程度時，黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)則會被破壞，因此山藥皮中總黃酮提取量不會隨著功率增加而抑制持續(xù)升高[12]。綜合考慮，選擇超聲波功率300W較好。

（四）料液比對總黃酮提取率的影響。稱取5組各1g干燥山藥粉，在超聲波功率為300W，分別加入10mL，20mL，30mL，40mL，50mL70%乙醇，超聲處理20min。液料比對山藥皮中總黃酮提取率影響見圖4。

圖4 液料比對總黃酮提取率的影響

由圖4 可以看出，隨著液料比的增大，提取率也隨之增加。但當達到50：1之后，提取率出現(xiàn)小幅度下降。分析原因可能是，提取溶劑量越大，形成的細胞壁內(nèi)外濃度差越大，擴散動力增強，山藥皮中的有效成分越容易從細胞內(nèi)滲出，提取率越高。但溶劑用量過大，會導(dǎo)致除黃酮類以外的物質(zhì)溶出，從而導(dǎo)致提取率降低，并且在實際生產(chǎn)過程中，溶劑用量太大會給后續(xù)的濃縮造成困難，使工業(yè)生產(chǎn)效率下降。但是，液料比也不能過低，否則會使山藥皮中的黃酮類化合物則不能被充分溶出，導(dǎo)致最終提取率將偏低。綜合考慮，本研究選擇液料比50：1較適宜。

（五）超聲時間對總黃酮提取率的影響。稱取6組各5g干燥山藥粉，在乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1：50，超聲波功率300W，條件下，先將6組樣品乙醇浸泡2h，再在超聲波分別處理10min，15min，20min，25min，30min，35min，超聲波時間對山藥皮中總黃酮提取率影響見圖5。

圖5 超聲波時間對總黃酮提取率的影響

由圖5可知超聲時間在10-20min時，隨著超聲時間的延長，總黃酮的提取率在增大，但當超聲時間超過20min后提取率出現(xiàn)下降，可能是加上前面2h的浸泡和超聲長時間處理導(dǎo)致溶劑乙醇大量揮發(fā)的原因，所以超聲時間20min為宜。

（六）響應(yīng)面模型的建立及顯著性分析。

1.響應(yīng)面設(shè)計方案。Box-Benhnken 實驗設(shè)計與結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Benhnken實驗設(shè)計和結(jié)果

2.方差及顯著性檢驗。用軟件Design-Expert.8.0.6進行乙醇體積分數(shù)、超聲功率、液料比及超聲時間四個因素對山藥皮中總黃酮提取率影響的回歸分析，分析結(jié)果見表3所示。對各個因素進行擬合，獲得回歸方程：總黃酮提取率（%）=+0.40+0.013A-2.917E-003B+3.500E-003C-6.250E-003D-0.015AB-2.500E-003AC-0.028AD+1.250E-003BC+6.750E-003 BD-7.250E-003CD-0.064 A2-0.080B2-0.077C2-0.055D2

表3 回歸方程方差分析

注：**差異極顯著（p<0.01）;*差異顯著（p<0.05）

由表3可見，回歸方程方程分析顯著性檢驗表明，該回歸模型顯著（p<0.0001），失擬項不顯著（p=0.1669>0.05），表明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。回歸方程中A、B、C、D的平方項p<0.01對響應(yīng)值的影響極顯著；一次項A和交互項AD對響應(yīng)值的影響顯著。各因素影響大小排序為A>D>C>B即乙醇體積分數(shù)>超聲時間>液料比>超聲功率。

3.最佳工藝參數(shù)的確定。通過Design-Expert.8.0.6軟件對回歸方程進行計算，得出超聲輔助乙醇提取山藥皮中總黃酮的最佳工藝條件，即乙醇體積分數(shù)為71.26%，超聲功率298.33W，液料比50.24：1，超聲時間為24.54，在此條件下，山藥皮中總黃酮的提取率理論值為0.4000193%?？紤]到在實際中操作的可行性，將各工藝條件修正為：乙醇體積分數(shù)為70%，超聲功率300W，液料比為50：1，超聲時間為25min，在此條件下進行三次重復(fù)實驗，得總黃酮提取率為0.399%，與理論預(yù)測值的相對誤差0.25%，再次驗證該回歸模型具有一定有效性。

圖6 乙醇體積分數(shù)與超聲功率的交互作用對提取率的影響

圖7 液料比與乙醇體積分數(shù)的交互作用對提取率的影響

圖8 超聲時間與乙醇體積分數(shù)的交互作用對提取率的影響

圖9 液料比與超聲功率的交互作用對提取率的影響

圖10 超聲時間與超聲功率的交互作用對提取率的影響

圖11 超聲時間與液料比的交互作用對提取率的影響

三、結(jié)論

采用超聲波輔助乙醇提取山藥皮中總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)為70%，超聲功率300W，液料比為50：1，超聲時間為25min，在此條件下進行三次重復(fù)實驗，得總黃酮提取率為0.421%，為實現(xiàn)資源利用最大化，提高山藥本身經(jīng)濟價值，提供科學(xué)依據(jù)。