李 冰, 李玉雙*, 陳 琳, 史榮久, 魏建兵,劉厶瑤, 宋雪英, 侯永俠, 陳紅亮

(1. 沈陽大學 環(huán)境學院, 遼寧 沈陽 110044;2. 中國科學院 沈陽應用生態(tài)研究所, 遼寧 沈陽 110016)

城市化是當前中國社會經(jīng)濟發(fā)展的重要過程,伴隨著城市化的快速推進[1],土地利用的格局、深度和強度不斷發(fā)生變化,人為活動引起的環(huán)境污染問題逐漸顯現(xiàn)[2],與城市化相關的土壤環(huán)境質量問題日益突出,這可能會影響到城市的生態(tài)安全及居民的身體健康.

土壤酶與土壤質量密切相關,是土壤中具有生物活性的蛋白質[3],參與土壤生態(tài)系統(tǒng)中進行的諸多重要的物質轉化和能量代謝過程[4-5].大量研究表明,土壤酶活性易受環(huán)境中物理、化學及生物因素的影響,具有綜合性、生物性和動態(tài)性特點,可以反映土壤的狀態(tài)和動態(tài)變化[6].因此,土壤酶活性的變化成為國內(nèi)外學者開展土壤環(huán)境質量研究的重要對象[7].土壤過氧化氫酶(CAT)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的氧化還原酶,有助于催化過氧化氫分解,減緩其對生物體的毒害作用[8].研究表明,土壤過氧化氫酶活性與土壤理化性質密切相關[9-10],多種環(huán)境因子對生物生理生化過程的影響,都可以通過生物體內(nèi)CAT表現(xiàn)出來[11].將其活性作為土壤質量的評價指標,具有一定的可靠性.

城市化進程中,伴隨著土地利用方式的改變,人為擾動強度增加,土壤理化性質和土壤細菌的組成結構也會發(fā)生相應變化.遲旭雯等[12]研究發(fā)現(xiàn),黑土由旱田改水田后,土壤pH升高;陳超等[13]研究結果表明,林地有機質含量顯著大于草地和農(nóng)田;章家恩等[14]研究表明6種不同土地利用方式下土壤微生物數(shù)量和多樣性具有顯著差別;彭木等[15]研究結果顯示農(nóng)田土壤的細菌數(shù)量大于林地土壤.這些研究表明,土壤理化性質和土壤細菌對土地利用方式具有敏感的響應,這必然會對土壤過氧化氫酶的活性產(chǎn)生重要影響.然而目前關于不同利用方式下土壤的理化性質,尤其是優(yōu)勢細菌菌群與土壤過氧化氫酶活性之間關系的研究還不明確.

沈陽市沈北新區(qū)是“國家可持續(xù)發(fā)展試驗區(qū)”,由于近年來城市化發(fā)展迅速,其大量農(nóng)業(yè)用地被用作城建用地,是我國城市擴張的典型區(qū)域.因此,本文通過分析不同土地利用類型土壤過氧化氫酶活性變化特征及其與土壤理化性質、土壤細菌優(yōu)勢菌群之間的相關關系,探討城市擴張區(qū)土壤過氧化氫酶活性的變化規(guī)律及其影響因素,為深入了解城市化對土壤環(huán)境質量的影響提供理論基礎和科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試土壤分布及樣品采集

采用均勻網(wǎng)格布點法在沈北新區(qū)設置101個采樣點(見圖1),經(jīng)緯度范圍為123°16′44.45″E～123°42′44.27″E,41°52′47.04″N～42°10′4.33″N.采樣時間為2015年9月15日—2015年10月6日,期間以晴和多云天氣為主.采樣點按土壤利用類型分為旱田、城市綠地、天然林地和水田.其中:旱田采樣點47個,種植作物以玉米(34個,已收割)為主,其他為蘿卜、胡蘿卜、西紅柿、黃瓜等蔬菜(成熟期)及苜蓿;城市綠地采樣點17個,植物種類主要為楊樹、山毛桃、火炬樹、灌叢、草坪草及雜草;天然林地采樣點15個,植被包括油松、榆樹、槭樹、蒙古櫟、楊樹;水田采樣點22個,種植作物為水稻.采用梅花布點法,將土壤表層( 0～20 cm) 5個位置的土壤樣品除去動植物殘體及石塊,混合均勻,帶回實驗室.一部分于-20 ℃冷凍保存,用于土壤細菌的高通量測序;另一部分室溫風干過篩,于4 ℃條件下保存,供土壤酶分析使用,一周內(nèi)完成土壤酶活性測定.

圖1 沈北新區(qū)土壤采樣點分布Fig.1 Location of sampling sites in Shenbei Area

1.2 土壤理化性質及CAT活性測定

使用激光粒度儀測定土壤機械組成[16],分別測定土壤中0.01～2 μm粒徑(黏粒)、2～20 μm粒徑(粉粒)、20～200 μm粒徑(砂粒)的含量;土壤容重采用環(huán)刀法測定;土壤含水量采用烘干法測定;土壤pH以土水比為1∶2.5,利用玻璃電極法測定;土壤有機質含量采用重鉻酸鉀-外加熱法測定[17];總氮采用重鉻酸鉀-硫酸消化法測定;總磷采用高氯酸、硫酸-鉬銻抗比色法測定[18].土壤過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定[19],每個樣品重復測定3次.

1.3 DNA提取與16S rDNA擴增

土壤總DNA的提取選用Powersoil DNA Isolation Kit (MoBio,USA)試劑盒,采用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和909R(5′-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′)擴增土壤細菌的16S rRNA基因V4區(qū).25 μL PCR反應體系:10×ExTaq buffer(含Mg2+)2.5 μL,2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL,10 μmol·L-1的上游barcode引物515F 1 μL,10 μmol·L-1的下游barcode引物909R 1 μL,5 U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶0.125 μL,DNA聚合酶2 μL,滅菌水補足體系至25 μL.PCR反應條件:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30次循環(huán)后在72 ℃終延伸5 min.

1.4 高通量測序及分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化、質控后,建立Illumina測序文庫,采用Illumina Miseq平臺進行Paired-end 250 bp測序,測序工作委托中國科學院成都生物研究所完成.測序結果(.fastq)切除原始序列兩端的測序接頭后經(jīng)FLASH軟件拼接,然后用QIIME軟件根據(jù)barcode將序列分配到相應樣品,去除低質量序列和嵌合體之后,統(tǒng)計每個樣品中的序列數(shù),以最少的序列數(shù)為標準進行樣品序列的重取樣,以保證每個樣品中含有的序列數(shù)相近,從而避免因序列數(shù)不同而導致的樣品間差異(抽平后得到8 720條有效序列).然后生成OTU(operational taxonomic unit,采用序列相似度閾值97%)表,從每個OTU中挑選出1條代表序列,與細菌16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)庫Greengenes進行比對,獲得各個OTU的物種分類信息.

1.5 數(shù)理統(tǒng)計分析

利用Arc GIS 10. 2 繪制采樣點位圖及酶活性分布圖.采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析,采用最小差數(shù)法(LSD)進行差異顯著性分析,通過Pearson(雙側)相關分析判斷土壤過氧化氫酶活性與土壤理化性質之間的相關性.利用Microsoft Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行通徑分析.采用Canoco for Windows 4.5軟件進行冗余分析,探究土壤細菌菌群與過氧化氫酶活性及土壤理化性質之間的關系.

2 結果與分析

2.1 土壤CAT活性空間分布特征

如圖2所示,石佛寺朝鮮族錫伯族鄉(xiāng)、興隆臺錫伯族鎮(zhèn)、尹家鄉(xiāng)北部等以水田為主的地區(qū)土壤過氧化氫酶活性較高;道義街道、虎石臺街道、蒲河街道等以城市綠地和天然林地為主的地區(qū)土壤過氧化氫活性居中;位于沈北新區(qū)中部的財落街道、新城子街道、黃家錫伯族鄉(xiāng)、清水臺鎮(zhèn)及東部的馬剛鄉(xiāng)等以旱田為主的地區(qū)土壤過氧化氫酶活性相對較低.總體上,沈北新區(qū)土壤過氧化氫酶活性呈現(xiàn)出由西至東逐漸降低的趨勢,這主要與其土地利用類型的區(qū)域分布有關.

圖2 沈北新區(qū)土壤過氧化氫酶活性空間分布特征Fig.2 Spatial distribution characteristics of soil CAT activity in Shenbei Area

2.2 不同土地利用類型土壤CAT活性變化特征

由圖3可見,水田土壤過氧化氫酶活性(1.59 mL·g-1)最高,城市綠地(1.37 mL·g-1)次之,天然林地(1.21 mL·g-1)和旱田(1.08 mL·g-1)土壤過氧化氫酶活性較低,這說明土壤過氧化氫酶活性受到土地利用方式的影響.植被和土壤微生物是土壤磷酸酶的重要來源,酶活性在一定程度上取決于植被和微生物的組成和結構.由于土地利用方式不同,如農(nóng)田存在種植、施加肥料、農(nóng)藥和灌溉等農(nóng)藝措施,城市綠地存在綠化養(yǎng)護措施,因而不同利用類型土地的理化性質、植被覆蓋、微生物群落結構具有很大差異,從而影響土壤過氧化氫酶的活性.在城市化過程中,大量農(nóng)業(yè)用地被轉變?yōu)槌墙ㄓ玫?其土壤過氧化氫酶活性也會相應地發(fā)生改變,直接影響土壤的氧化還原能力,從而改變土壤環(huán)境質量.就農(nóng)業(yè)用地而言,水田改為城市綠地后土壤過氧化氫酶活性變化不顯著;而旱田變更為城市綠地后其土壤過氧化氫酶活性將會顯著提高,有利于降低過氧化氫對生物體的毒害作用.

圖3不同利用類型土壤過氧化氫酶活性變化情況

Fig.3 Changes of CAT activity in different utilization types of land

2.3 土壤理化性質對土壤CAT活性的影響

由表1可知,土壤pH由高到低為城市綠地、水田、旱田、天然林地;水田土壤含水質量分數(shù)顯著高于其他利用類型土壤,旱田、城市綠地和天然林地之間均不存在顯著差異;與另外3種利用類型土壤相比,城市綠地土壤容重較大,天然林地和水田容重次之,旱田容重較小,但這3者之間差異不明顯;土壤黏粒體積分數(shù)變化特點與含水質量分數(shù)相似;水田粉粒體積分數(shù)顯著高于其他3種利用類型土壤,旱田、城市綠地和天然林地間粉粒體積分數(shù)相近,變化不明顯;天然林地、城市綠地和旱田砂粒體積分數(shù)較高,顯著大于水田;天然林地有機質(TOC)質量分數(shù)最高,水田、城市綠地和旱田有機質質量分數(shù)次之,相互之間差異不明顯;土壤總氮(TN)質量分數(shù)變化特點與有機質相似;城市綠地土壤總磷(TP)質量分數(shù)顯著低于其他3種利用類型土壤,旱田、水田和天然林地之間不存在顯著差異.

表1 不同利用類型土壤理化性質Table 1 Soil physicochemical properties different utilization types of land

如表2所示,土壤過氧化氫酶活性與土壤pH、含水質量分數(shù)呈極顯著正相關(P<0.01),與容重呈顯著正相關(P<0.05),與土壤機械組成(黏粒、粉粒和砂粒)體積分數(shù)和有機質、總氮及總磷的質量分數(shù)相關性不顯著,說明土壤pH、含水質量分數(shù)和容重是影響土壤過氧化氫酶活性的重要因素.

對數(shù)據(jù)進一步進行通徑分析(表3),pH和含水因素對過氧化氫酶活性的直接通徑系數(shù)較大,而間接通徑系數(shù)較小,說明pH和含水量變化可以直接作用于土壤過氧化氫酶活性;容重對過氧化氫酶活性的直接通徑系數(shù)較小,而通過pH和含水因素對土壤過氧化氫酶活性的間接通徑系數(shù)較大,說明容重主要分別通過改變pH和含水量間接作用于土壤過氧化氫酶活性;黏粒、砂粒對過氧化氫酶活性的直接通徑系數(shù)較大,說明它們對過氧化氫酶活性具有強烈的直接效應.然而,它們對土壤過氧化氫酶活性的直接效應被通過其他因素對土壤過氧化氫酶活性的反向間接效應所抵消,因而表現(xiàn)為它們與土壤過氧化氫酶活性的相關性較小.黏粒、粉粒、砂粒通過含水因素對過氧化氫酶活性的間接通徑系數(shù)均比通過其他因素的間接通徑系數(shù)大,說明土壤機械組成對過氧化氫酶活性也有一定的影響.

表2土壤過氧化氫酶活性與土壤理化因素的相關分析
Table 2 Correlative analysis of soil CAT activity and soil physicochemical properties

項 目pH含水質量分數(shù)容重含黏粒體積分數(shù)含粉粒體積分數(shù)含砂粒體積分數(shù)有機質質量分數(shù)總氮質量分數(shù)總磷質量分數(shù)土壤過氧化氫酶活性0.579??0.459??0.242?0.040.082-0.0910.040.027-0.077

注: *表示P<0.05,**表示P<0.01(Pearson相關,雙側)

表3 土壤理化因素對土壤過氧化氫酶活性的通徑分析Table 3 Path analysis of soil physicochemical properties on CAT activity

土壤pH變化一方面可以改變酶的空間構象、氨基酸殘基微環(huán)境或者改變酶與土壤顆粒之間的結合狀態(tài), 從而使土壤酶的催化活性發(fā)生變化; 另一方面可以在土壤微生物代謝和群落結構水平上影響酶的數(shù)量和活性[20]. 王涵等[21]通過在本底pH值為4.77的土壤中添加H+和OH-, 考察酸化或堿化對土壤酶的影響, 研究結果表明, 添加OH-對土壤過氧化氫酶活性起刺激作用, 而添加H+則呈現(xiàn)抑制作用, 且激活/抑制作用與OH-/H+添加量呈正相關. 崔嶸等[22]研究表明, pH與過氧化氫酶活性呈顯著正相關. 劉炳君等[23]研究發(fā)現(xiàn), 酸性土壤經(jīng)石灰調節(jié), pH提高1～2,引起土壤細菌數(shù)量增加10倍以上, 土壤過氧化氫酶活性升高. 土壤含水質量分數(shù)也是影響過氧化氫酶活性的重要因素, 土壤水分可以直接影響酶活性的高低, 也可以通過影響微生物的生長和土壤養(yǎng)分的有效性而間接影響土壤酶活性[24]. 解麗娜等[25]研究表明, 土壤水分是影響土壤酶活性的主要因素之一, 與過氧化氫酶活性顯著正相關. 李旺霞等[26]發(fā)現(xiàn)土壤含水量較大時, 土壤酶活性較高,但土壤含水量過高時, 土壤酶活性則減弱.這些研究結論與本文研究結果相一致. 土壤容重通過間接作用成為影響土壤過氧化氫酶活性的重要因素. 土壤容重受土壤孔隙的影響, 土壤孔隙總量及大小分布又反映了土壤通氣蓄水性能. 容重適宜、結構良好的土壤氧氣充沛, 適宜微生物生長, 促進了土壤有機碳、氮的分解, 土壤呼吸速率加快, 間接提高了酶活性[27-29]. 土壤機械組成對土壤緊實度、通透性能及肥力狀況具有重要影響, 進而影響到土壤微生物活動和土壤酶活性[30-32]. 本文結果表明土壤機械組成與土壤含水質量分數(shù)相關性明顯, 黏粒、粉粒體積分數(shù)增加, 土壤持水能力增強, 含水質量分數(shù)提高; 而砂粒體積分數(shù)增加, 土壤結構疏松, 孔隙增大, 含水質量分數(shù)下降, 說明土壤機械組成可以通過土壤含水質量分數(shù)間接影響過氧化氫酶酶活性.

2.4 土壤細菌群落組成對土壤CAT活性的影響

2.4.1 土壤細菌多樣性與土壤CAT活性的關系

土壤微生物作為土壤中最活躍的組成部分在物質循環(huán)、養(yǎng)分分解過程中具有重要作用,是土壤酶的主要來源[33].土壤酶活性在一定程度上取決于微生物的組成和結構[34].如圖4所示,沈北新區(qū)不同土地利用類型土壤中細菌的Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)呈現(xiàn)出相同的變化特點,即由高到低依次為:水田、城市綠地、天然林地、旱田,旱田和天然林地土壤中細菌的多樣性顯著低于水田和城市綠地(P<0.05),土壤細菌多樣性變化特征與土壤過氧化氫酶活性變化的特征相一致.土壤過氧化氫酶活性與Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)呈顯著正相關(表4),表明土壤過氧化氫酶活性受土壤中細菌多樣性的影響,細菌多樣性越高,豐度越大,酶活性越高.

圖4 不同利用類型土壤細菌Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)的變化情況Fig.4 Changes of soil microbial community diversity Chao1 index and Shannon index in different utilization types of land

表4 土壤過氧化氫酶活性與土壤細菌Chao1指數(shù)及shannon指數(shù)的相關關系

2.4.2 土壤優(yōu)勢菌群與土壤CAT活性的關系

本文通過對土壤樣品中細菌的16S rRNA基因的V4高變區(qū)進行Illumina測序,共檢測到70個菌門,進一步對相對豐度>10%的優(yōu)勢菌群和土壤理化性質及過氧化氫酶活性做RDA分析(圖5),從圖中射線長度及夾角大小可以看出土壤理化性質、細菌菌群及過氧化氫酶活性間的關系,綠彎菌門、擬桿菌門、藍藻細菌、變形菌門與土壤過氧化氫酶活性呈正相關,其相關性依次減小,這說明土壤過氧化氫酶活性主要受到這些菌群的作用,其中綠彎菌門和擬桿菌門對土壤過氧化氫酶影響較大.RDA分析結果還表明,上述4個菌門與土壤pH、含水質量分數(shù)和容重呈正相關,與上文土壤過氧化氫酶活性隨土壤pH、含水質量分數(shù)和容重的變化趨勢相吻合,提示這些菌群可能是土壤過氧化氫酶的重要來源.

a1—泉古菌門(Crenarchaeota);a2—酸桿菌門(Acidobacteria);a3—放線菌門(Actinomycetes);a4—擬桿菌門(Bacteroidetes);a5—綠彎菌門(Chloroflexi);a6—藍藻細菌(Cyanobacteria);a7—厚壁菌門(Firmicutes);a8—疣微菌門(Verrucomicrobia);a9—變形菌門(Proteobacteria)

3 結 論

1) 土地利用方式影響土壤過氧化氫酶活性,沈北新區(qū)不同土地利用類型土壤過氧化氫酶活性由高到低依次為:水田、城市綠地、天然林地、旱田.

2) 土壤pH、含水質量分數(shù)和容重是影響土壤過氧化氫酶活性的主要因素.土壤機械組成可以通過調節(jié)土壤含水量對過氧化氫酶活性產(chǎn)生影響.

3) 土壤過氧化氫酶活性與綠彎菌門、 擬桿菌門、 藍藻細菌、 變形菌門呈正相關關系, 其中, 綠彎菌門和擬桿菌門對土壤過氧化氫酶的影響較大.