程亮 陳華昕 趙新國 陳惠芬 華少鵬 施敏驊

1無錫市第五人民醫(yī)院呼吸科214005；2蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸科215004

結(jié)核性胸膜炎是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的胸膜炎癥病變，傳統(tǒng)的診斷方法是依靠顯微鏡下胸腔積液涂片中找到抗酸桿菌，但其陽性率很低，僅7%～13%不等[1]。胸腔積液結(jié)核菌培養(yǎng)可顯著提高檢測陽性率至23%～67%[2]，但其培養(yǎng)周期長達1個月。通過內(nèi)科胸腔鏡對胸膜病變進行病理活檢可以作為診斷結(jié)核性胸膜炎的金標(biāo)準，然而內(nèi)科胸腔鏡是侵入性的，增加了相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，并且胸腔鏡技術(shù)在多數(shù)基層醫(yī)院仍未廣泛普及，因此有必要尋找一種快速、有效、簡便的方法來輔助診斷結(jié)核性胸膜炎。本研究探討結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液及外周血中IL-27的表達及其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象及診斷標(biāo)準

1.1.1 研究對象及分組 根據(jù)結(jié)核性胸膜炎和惡性胸腔積液的最新診斷標(biāo)準[3-4]，對2017年11月至2018年5月無錫市第五人民醫(yī)院呼吸科收治的胸腔積液患者進行篩選，最終67例結(jié)核性胸膜炎患者中共有53例納入本項研究(7例隨訪流失，5例臨床診斷患者修正為其他疾病，2例患者追問病史接受過抗結(jié)核治療)，為結(jié)核組，其中男31例，女22例；年齡(38.3±7.8)歲，年齡范圍為19～65歲。結(jié)核組中確診病例30例，包括胸腔鏡病理活檢明確結(jié)核12例，胸腔積液結(jié)核菌培養(yǎng)陽性8例，胸腔積液結(jié)核菌核酸檢測陽性12例；臨床診斷23例。共49例惡性胸腔積液患者納入本項研究，為惡性組，其中男29例，女20例；年齡(62.5±10.3)歲，年齡范圍為46～78歲。以50名體檢中心健康體檢人員為健康對照組，其中男23名，女27名；年齡(59.3±5.3)歲，年齡范圍為52～68歲。所有患者未接受過抗腫瘤治療、免疫治療或抗結(jié)核治療，未使用過糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑或非甾體抗炎藥。本研究通過無錫市第五人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.1.2 診斷標(biāo)準 結(jié)核組入選標(biāo)準依據(jù)2017年《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準-肺結(jié)核診斷》[3]。結(jié)核性胸膜炎確診標(biāo)準:(1)胸膜病理檢查支持結(jié)核；(2)胸腔積液抗酸桿菌陽性2次；(3)胸腔積液抗酸桿菌陽性1次，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性1次；(4)胸腔積液結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性。結(jié)核性胸膜炎臨床診斷標(biāo)準:(1)胸腔積液為滲出液，腺苷脫氨酶升高，同時γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)釋放試驗陽性；(2)胸腔積液為滲出液，腺苷脫氨酶升高，同時PPD中度陽性或強陽性；(3)胸腔積液為滲出液，腺苷脫氨酶升高，同時結(jié)核分枝桿菌抗體陽性。

惡性組入選標(biāo)準:在胸腔積液細胞沉淀中找到惡性細胞，或在胸膜活檢組織中觀察到惡性腫瘤的病理變化[4]。

健康對照組入選標(biāo)準:無錫市第五人民醫(yī)院體檢中心參加健康體檢的人員(年齡≥18歲)，常規(guī)體檢結(jié)果均正常。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要的試劑和儀器 IL-27酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(美國Bio Legend公司)；酶標(biāo)儀(美國Biokit公司)；低溫高速離心機、HERAcell 150i二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；ELx-800型全自動酶標(biāo)分析儀(美國biokit公司)；FC500型流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)；Th1/Th2細胞因子檢測試劑盒(美國BD公司)。

1.2.2 標(biāo)本收集 入院24 h內(nèi)采集結(jié)核組及惡性組患者空腹外周靜脈血20 ml，留取健康對照者的體檢殘余血5 ml，存于肝素抗凝管中。采用標(biāo)準的胸腔穿刺術(shù)采集結(jié)核組及惡性組患者胸腔積液并用肝素抗凝。所有標(biāo)本均經(jīng)離心半徑為16 cm，2 000 r/min離心5 min，取上清液置于-80℃冰箱凍存。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測 將50 ml的20×洗滌液溶于950 ml的蒸餾水里作為緩沖液。將2.06 ml的緩沖液加入到凍干的人類IL-27標(biāo)準品瓶里，放于振蕩器上混勻。用緩沖液將標(biāo)準品儲備液倍比稀釋為16μg/L、8μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L、500 ng/L、250 ng/L。用1×洗滌液洗板，每次洗板將1×洗滌液浸泡96孔板30 s。每孔加入50μl的緩沖液。每孔加入50μl的標(biāo)準品溶液或標(biāo)本。用封板模封板，在搖床上搖10 min后放于室溫孵育110 min。然后倒掉孔內(nèi)溶液后洗板4次。每孔加入100μl的IL-27檢測抗體然后用封板模封板，搖床上搖10 min后放于室溫孵育50 min。然后倒掉孔內(nèi)溶液后洗滌液洗板4次。每孔加入100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測液體，避光放于37℃溫箱內(nèi)孵育，40 min后除空白對照孔外其余孔都變藍。每孔加入100μl的終止液終止反應(yīng)，輕敲混勻。在30 min內(nèi)，在酶標(biāo)儀450 nm下讀吸光度值。用Curve Expert 1.3 Setup繪制標(biāo)準曲線，得出相應(yīng)的濃度(ng/L)。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測 將凍干的人Th1/Th2標(biāo)準品轉(zhuǎn)移到15 ml錐形離心管中，并標(biāo)記該管為最高濃度標(biāo)準品。取出9根12 mm×75 mm流式上樣管，分別標(biāo)記梯度稀釋的倍數(shù)1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。從1∶2管取300μl液體到1∶4管，吹打混勻，依此類推，直到1∶256管。確定實驗管數(shù)(包括標(biāo)準品和對照管)，混合前每種捕獲微球需充分渦旋3～5 s。為保證每個實驗管都含有7種微球，每種捕獲微球需各取10μl。將混合好的捕獲微球200×g離心5 min，小心吸去上清，室溫避光孵育30 min。渦旋混勻混合好的捕獲微球，每個實驗管都加入50μl待測樣本。所有實驗管中都加入50μl人Th1/Th2 PE檢測試劑。所有實驗管室溫避光孵育3 h。每管加入1 ml洗液，200×g離心5 min，棄去上清，每管加300μl洗液，重懸微球。完成樣本數(shù)據(jù)獲取后，使用FCAP Array軟件來進行人Th1/Th2細胞因子數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0以及Graph pad prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析并繪制統(tǒng)計圖。所有數(shù)據(jù)使用Komogorov-Smirnov test檢驗變量是否服從正態(tài)性分布，符合正態(tài)分布的計量資料采用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；兩組間的率比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。繪制受試者工作特征曲線，根據(jù)曲線下面積(area under curve，AUC)綜合評價診斷試驗的診斷價值。

2 結(jié)果

2.1 治療前不同性質(zhì)胸腔積液及血清中IL-27的水平 結(jié)核組胸腔積液IL-27水平、IL-27胸腔積液/血清均高于惡性組(t=8.47、8.32，P值均＜0.05)。惡性組血清IL-27水平高于結(jié)核組及健康對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.76，P＞0.05)。結(jié)核組胸腔積液IL-27水平顯著高于其血清IL-27水平(t=11.30，P＜0.001)。見表1。

表1 3組受試者血清及胸腔積液中IL-27濃度的比較()

表1 3組受試者血清及胸腔積液中IL-27濃度的比較()

注:與健康對照組比較，a P＜0.05；與胸腔積液比較，b P＜0.05

組別 例數(shù) 血清(ng/L)胸腔積液(ng/L)胸腔積液/血清結(jié)核組 53 285.20±44.59ab 516.45±144.25 1.85±0.56惡性組 49 293.16±59.37 313.30±86.61 1.09±0.32健康對照組50 264.28±84.37統(tǒng)計值 F=2.76 t=8.47 t=8.32 P值 0.066 ＜0.001 0.005

2.2 不同性質(zhì)胸腔積液中IL-2、IL-10、IFN-γ的基線水平 結(jié)核組胸腔積液IL-10及IFN-γ水平高于惡性組(t=3.04、9.81，P值均＜0.05)，結(jié)核組與惡性組胸腔積液IL-2水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 結(jié)核組與惡性組患者胸腔積液中IL-2、IL-10、IFN-γ的比較()

表2 結(jié)核組與惡性組患者胸腔積液中IL-2、IL-10、IFN-γ的比較()

注:IFN-γ為γ-干擾素

組別 例數(shù)IL-2(ng/L)IL-10(ng/L)IFN-γ(ng/L)結(jié)核組53 28.00±8.95 398.08±19.45 704.17±169.53惡性組49 25.81±6.16 366.53±73.76 465.80±45.65 t值 1.58 3.04 9.81 P值 0.120 0.004 ＜0.001

2.3 胸腔積液IL-27、IL-10、IFN-γ以及聯(lián)合三者對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值 胸腔積液IL-27的cut-off值 為377.3 ng/L時，約 登 指 數(shù) 最 高(0.66)，AUC為0.915，95%CI:0.862～0.969，診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度為88.0%，特異度為78.0%。胸腔積液IL-10的cut-off值為371.67 ng/L時，約登指數(shù)最高(0.57)，AUC為0.629，95%CI:0.506～0.751，診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度為87.1%，特異度為58.5%。胸腔積液IFN-γ的cut-off值為513.65 ng/L時，約登指數(shù)最高(0.71)，AUC為0.897，95%CI:0.836～0.959，診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度為81.1%，特異度為90.6%。診斷結(jié)核性胸膜炎的多變量受試者工作特征曲線分析顯示，胸腔積液中IL-27、IL-10及IFN-γ聯(lián)合的cut-off值為0.43時，約登指數(shù)最高(0.87)，AUC為0.983，95%CI:0.964～1.000，診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度為95.9%，特異度為90.6%(圖1)。

圖1 多種細胞因子診斷結(jié)核性胸腔積液的受試者工作特征曲線

3 討論

既往的研究已表明[5]，宿主感染了結(jié)核分枝桿菌后，主要產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，分泌大量炎性因子，促炎性細胞因子、抗炎性細胞因子和趨化因子之間的相互作用和比例失衡與結(jié)核性胸膜炎的發(fā)病有關(guān)。在結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中IL-10和IFN-γ可顯著增高，對結(jié)核性胸膜炎患者的輔助診斷具有較高的敏感度和特異度，而細胞因子檢測在結(jié)核感染診斷中的價值已被越來越多的臨床研究證實[6]。自IFN-γ檢測被引入臨床酶學(xué)后，已逐漸應(yīng)用于臨床輔助診斷結(jié)核性胸膜炎[7]，甚至在歐美國家IFN-γ釋放試驗已被批準取代PPD法用于臨床檢測結(jié)核菌感染[8]。但也有一部分研究者認為實際情況并非如此，并對相關(guān)的文獻回顧分析發(fā)現(xiàn)[9]，胸腔積液IFN-γ檢測結(jié)核性胸膜炎的敏感度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、診斷優(yōu)勢比分別為78%、82%、3.49、0.24、85%、70%和19.04，并且認為胸腔積液IFN-γ無法區(qū)分活動性和非活動性結(jié)核，結(jié)果易受接觸活動性結(jié)核患者和結(jié)核感染等因素影響，因此其作為單獨指標(biāo)在臨床診斷中意義有限，而相對來說用于排除結(jié)核感染的意義更大。同時也有研究發(fā)現(xiàn)IL-10可作為輔助診斷結(jié)核病的生物標(biāo)記物之一。Joshi等[10]通過測定活動性肺結(jié)核患者、家庭接觸者和健康對照組血清中IL-10的濃度，發(fā)現(xiàn)IL-10可用于區(qū)分以上三者。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)核組患者胸腔積液IL-27水平較惡性組增高，并且結(jié)核組患者IL-27胸腔積液/血清較惡性組亦明顯增高，推測胸腔中的IL-27不是來自外周血，而是由胸腔積液局部微環(huán)境中產(chǎn)生的，原因可能是結(jié)核分枝桿菌侵犯入胸膜腔導(dǎo)致胸膜血管通透性增加，形成以淋巴細胞為主的滲出液，誘發(fā)局部以CD4+T淋巴細胞為主的遲發(fā)型超敏反應(yīng)所致[11]?；罨腃D4+T淋巴細胞分泌大量IFN-γ，IFN-γ可以 誘 導(dǎo)Th0細 胞向Th1細胞分化，活化更多的細胞毒性T淋巴細胞和效應(yīng)T細胞以殺死或抑制結(jié)核分枝桿菌。IL-27由活化的單核細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，繼而可以誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生[12]，因此我們推測結(jié)核性胸腔積液微環(huán)境中IFN-γ水平與IL-27水平呈正相關(guān)性。有文獻表明IL-27作為鑒別診斷結(jié)核性胸腔積液的參考指標(biāo)得到了普遍肯定[13]，但其檢測結(jié)果在國內(nèi)外眾多試驗中存在差異，分析原因可能為:(1)胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌抗原刺激單核細胞產(chǎn)生IL-27呈時間-劑量依賴關(guān)系，因此結(jié)核感染的不同時期胸腔積液中產(chǎn)生的IL-27存在差異[14]。(2)部分試驗樣本量仍偏少，導(dǎo)致試驗結(jié)果差異較大。同時在本研究中也發(fā)現(xiàn)，惡性胸腔積液患者胸腔積液IL-27濃度高于其血清，這可能與IL-27可直接抑制部分腫瘤細胞的增殖，且其在腫瘤微環(huán)境中還具有抗血管生成作用有關(guān)[15]，但其免疫學(xué)機制尚不完全清楚，仍需進一步研究。

為進一步探索IL-27在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價值，本研究采用受試者工作特征曲線來檢驗此指標(biāo)的診斷效能，發(fā)現(xiàn)IL-27水平具有對結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜炎的鑒別診斷價值。本研究通過對多個細胞因子進行同步檢測發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中IL-10和IFN-γ顯著高于對照組，進一步分析顯示在結(jié)核性胸腔積液中IFN-γ的特異度最高，但敏感度差，IL-27的敏感度在三者中最高，但其特異度略低于IFN-γ，而IL-10的特異度和敏感度在三者比較中均無優(yōu)勢。因此，在進行排除診斷時可以選擇特異度較高的IFN-γ，而確診時則選擇敏感度較高的IL-27，并且IL-10、IL-27和IFN-γ3種細胞因子聯(lián)合診斷的敏感度與特異度分別為95.9%和90.6%，和單獨使用IL-27檢測相比無明顯優(yōu)勢，而同時檢測多個細胞因子費用則明顯增高。

鑒于胸腔積液IL-27檢測對于診斷結(jié)核性胸膜炎擁有較高的敏感度和特異度，特別是酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測法相對流式檢測費用更低，操作程序簡單，技術(shù)要求低，可作為適宜技術(shù)向基層醫(yī)院進行推廣和普及。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突