楊瑩 吳小玲 鄧治平

自貢市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科643000

肺癌是全球癌癥死亡主要原因之一，早期肺癌缺乏特異性癥狀和診斷標(biāo)志物。痰細(xì)胞學(xué)和低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描是診斷和篩查早期肺癌的主要手段，組織學(xué)活檢是肺癌診斷的主要依據(jù)[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌病例的85%，診斷時(shí)常處于中晚期，導(dǎo)致預(yù)后不佳。探討NSCLC非侵入性血清標(biāo)志物對(duì)NSCLC早期診斷尤為重要[2]。

S100蛋白家族包含25個(gè)鈣結(jié)合蛋白，其多個(gè)成員參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞周期進(jìn)程，在細(xì)胞分化、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。S100A2是S100蛋白家族重要成員之一，在早期NSCLC患者中，其表達(dá)水平增加，且與NSCLC患者預(yù)后不良相關(guān)[4]。S100A6是S100蛋白家族另一個(gè)成員，在NSCLC、肝細(xì)胞癌和急性白血病患者中觀察到細(xì)胞質(zhì)S100A6表達(dá)增加[5]。S100A6蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架重排和泛素化蛋白降解[6]。采用免疫組織化學(xué)或蛋白質(zhì)印跡法均可在NSCLC中檢測(cè)到S100A2和S100A6蛋白異常表達(dá)，而NSCLC患者血清中S100A2和S100A6蛋白濃度及其臨床意義國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢查新診斷的原發(fā)性NSCLC患者和健康受試者的血清中S100A2和S100A6蛋白濃度，并評(píng)估其臨床診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究納入自2018年1月至12月自貢市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科共招募最新診斷且組織學(xué)證實(shí)為原發(fā)性NSCLC患者141例為NSCLC組。所有患者均獲得病理診斷資料，并根據(jù)TNM分期第八版進(jìn)行分類[7]。納入標(biāo)準(zhǔn):病理組織學(xué)診斷為NSCLC，未接受任何放化療。排除標(biāo)準(zhǔn):存在NSCLC外其他惡性腫瘤。選取同時(shí)間段在自貢市第一人民醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)年度健康檢查年齡和性別相匹配健康個(gè)體150名作為健康對(duì)照組。健康對(duì)照組受試者不存在惡性腫瘤，并且沒(méi)有任何腫瘤家族史。本研究通過(guò)自貢市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(CL2017120941)，所有參與研究的受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法 采用標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)卷從參與研究者中收集年齡、性別、吸煙狀態(tài)、腫瘤分期、組織學(xué)類型、分化狀態(tài)等信息。

1.2.1 血清樣本收集 采集所有參與研究者空腹靜脈血8 ml，4℃以1 500×g離心10 min，分離得到血清，將血清樣品在冷凍管中分成100μl等分試樣，儲(chǔ)存在-80℃直到統(tǒng)一分析。

1.2.2 血清S100A2和S100A6蛋白濃度檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)研究對(duì)象血清中S100A2和S100A6蛋白濃度，ELISA試劑盒購(gòu)自武漢聯(lián)合生物技術(shù)公司。人S100A2蛋白ELISA試劑盒(目錄號(hào):SEC009 Hu)和人S100A6蛋白ELISA試劑盒(目錄號(hào):SEB769Hu)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)S100A2和S100A6蛋白濃度。S100A2靈敏度為0.124μg/L，測(cè) 范圍為0.312～20μg/L；S100A6靈敏度為32 ng/L，測(cè)定范圍為78～15 000 ng/L。針對(duì)每份血清樣本檢測(cè)3次，取平均值作為最終分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示；采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)比較NSCLC組和健康對(duì)照組之間差異，多組之間比較采用單因素方差分析。受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析血清S100A2和S100A6蛋白濃度對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 NSCLC組共141例，其中男111例，女30例；年齡(61.11±0.74)歲，年齡范圍為39～75歲。健康對(duì)照組共150名，其中男114名，女36名；年齡(60.57±0.55)歲，年齡范圍為40～74歲。2組患者性別和年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＞0.05)。健康對(duì)照組和NSCLC組吸煙比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(60例比105例，χ2=35.171，P=0.03)。NSCLC組中腺癌71例(50.4%)，鱗狀細(xì)胞癌70例(49.6%)；TNM分 期Ⅰ期16例(11.3%)，Ⅱ期14例(9.9%)，Ⅲ期46例(32.6%)，Ⅳ期65例(46.1%)；高分化10例(7.1%)，中分 化67例(47.5%)，低分化64例(45.4%)。

2.2 血清S100A2/A6濃度比較 NSCLC組患者血清S100A2濃度高于健康對(duì)照組(t=3.794，P＜0.001)；NSCLC組患者血清S100A6濃度高于健康對(duì)照組(t=70.320，P＜0.001)，見(jiàn)表1。

表1 2組患者血清S100A2和S100A6蛋白濃度比較()

表1 2組患者血清S100A2和S100A6蛋白濃度比較()

組別 例數(shù) S100A2(μg/L)S100A6(ng/L)非小細(xì)胞肺癌組141 15.02±0.79 12 760.0±651.8健康對(duì)照組 150 11.18±0.64 8 434.0±408.2 t值 3.794 70.320 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 NSCLC患者不同TNM分期血清S100A2和S100A6濃度比較 早期(Ⅰ+Ⅱ期)NSCLC患者和晚期(Ⅲ+Ⅳ期)NSCLC患者血清S100A2濃度均高于健康對(duì)照組(P值均＜0.05)；早期(Ⅰ+Ⅱ期)NSCLC患者和晚期(Ⅲ+Ⅳ期)NSCLC患者血清S100A6濃度均高于健康對(duì)照組(P值均＜0.05)，見(jiàn)圖1、2。

圖1 不同TNM分期NSCLC組與健康對(duì)照組血清S100A2蛋白濃度比較

2.4 血清S100A2和S100A6蛋白濃度對(duì)NSCLC診斷價(jià)值 采用ROC曲線評(píng)估血清S100A2和S100A6蛋白濃度對(duì)NSCLC患者和健康志愿者診斷區(qū)分能力。當(dāng)cut-off值為13.81μg/L時(shí)，血清S100A2濃度區(qū)分NSCLC與健康對(duì)照者的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.696，特異度為82.0%，敏感度為59.3%；當(dāng)cut-off值為10 152 ng/L時(shí)，血清S100A6濃度區(qū)分NSCLC與健康對(duì)照者的AUC為0.738，特異度為64.0%，敏感度為61.7%(圖3、4)。進(jìn)一步分析顯示，血清S100A2蛋白濃度cut-off值為12.42μg/L；其區(qū)分Ⅰ+Ⅱ期NSCLC與健康對(duì)照者ROC曲線的AUC為0.708，特異度為71.8%，敏感度為75.0%；血清S100A6蛋白濃度cut-off值為16 829 ng/L時(shí)，其區(qū)分Ⅰ+Ⅱ期NSCLC與健康對(duì)照者ROC曲線的AUC為0.702，特異度為99.6%，敏感度為42.9%。

圖2 不同TNM分期NSCLC組與健康對(duì)照組血清S100A6蛋白濃度比較

圖3 血清S100A2蛋白濃度診斷非小細(xì)胞肺癌的ROC曲線

2.5 血清S100A2和S100A6蛋白濃度與NSCLC患者臨床參數(shù)相關(guān)性 NSCLC患者血清中S100A2和S100A6濃度與患者的年齡、性別、吸煙狀況、組織學(xué)、TNM分期和分化狀態(tài)均無(wú)相關(guān)性(P值均＞0.05)，S100A2和S100A6濃度與患者腫瘤大小有相關(guān)性(r=0.89、0.91，P值均＜0.05)，見(jiàn)表2。

圖4 血清S100A6蛋白濃度診斷非小細(xì)胞肺癌的ROC曲線

3 討論

NSCLC是癌癥死亡主要原因之一，導(dǎo)致其預(yù)后不佳的重要原因之一為患者診斷時(shí)常處于中晚期，無(wú)法手術(shù)完全治愈。NSCLC患者缺乏有效的非侵入性生物標(biāo)志物用于早期診斷[8]。本研究探討血清S100蛋白家族S100A2和S100A6在NSCLC診斷和早期檢測(cè)中的臨床價(jià)值。

本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清中S100A2和S100A6蛋白濃度均顯著高于健康對(duì)照者，進(jìn)一步證實(shí)S100A2和S100A6蛋白家族參與了NSCLC發(fā)生和進(jìn)展病理生理過(guò)程。S100蛋白家族包含25個(gè)已知成員，每個(gè)成員由一個(gè)單獨(dú)的基因編碼，其中22個(gè)基因聚集在染色體位點(diǎn)1q21[9]。與鈣離子結(jié)合后，大多數(shù)S100蛋白經(jīng)歷構(gòu)象變化，與各種蛋白質(zhì)靶標(biāo)相互作用，發(fā)揮廣泛的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外功能[10]。S100蛋白家族成員S100A2和S100A6與包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥有關(guān)。最新研究報(bào)道S100A2通過(guò)誘導(dǎo)EMT過(guò)程而增加A549肺癌細(xì)胞系的侵襲能力，細(xì)胞增殖能力和Akt磷酸化，調(diào)節(jié)TGF-β/Smad-3過(guò)程，促進(jìn)腫瘤靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[10]。Diederichs等[11]最先發(fā)現(xiàn)S100A2蛋白在早期NSCLC組織中過(guò)度表達(dá)，且與NSCLC患者轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；S100A2蛋白高m RNA表達(dá)水平與手術(shù)切除的NSCLC患者的生存率低有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清S100A2蛋白濃度顯著高于健康對(duì)照者，與上述結(jié)果一致。S100A6最初被鑒定為在急性白血病中上調(diào)，并且與肺癌、結(jié)腸癌的預(yù)后和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[13]。S100A6在胰腺癌中誘導(dǎo)EMT并促進(jìn)β-catenin依賴性細(xì)胞遷移和侵襲[14]。S100A6被證明與p53相互作用并增強(qiáng)p53轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)p53的凋亡作用。在NSCLC中，He等[15]報(bào)道S100A6在25%的早期NSCLC中表達(dá)陽(yáng)性，而正常肺組織中表達(dá)陰性，本研究中也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)早期NSCLC患者血清中S100A6蛋白濃度增加。另一方面，其他腫瘤研究也有報(bào)道稱腫瘤患者血清中S100A2和S100A6蛋白增高，因此，這2種指標(biāo)在應(yīng)用時(shí)需校正其特異性。

表2 血清S100A2和S100A6蛋白與非小細(xì)胞肺癌患者臨床參數(shù)相關(guān)性

本研究發(fā)現(xiàn)血清S100A2和S100A6蛋白濃度可有效區(qū)分NSCLC與健康受試者，且ROC曲線分析顯示獲得良好的診斷效能:S100A2蛋白診斷NSCLC的AUC為0.696，特異度為82.0%，敏感度為59.3%，S100A6蛋白診斷NSCLC的AUC為0.738，特異度為64.0%，敏感度為61.7%，提示2種蛋白可幫助臨床醫(yī)師檢測(cè)NSCLC。但對(duì)于早期(Ⅰ+Ⅱ期)NSCLC患者，S100A6蛋白診斷NSCLC的敏感度為42.9%，低敏感度降低了其對(duì)早期肺癌篩查的臨床價(jià)值。鑒于NSCLC非侵入性分子標(biāo)志物較少，其與NSCLC其他分子標(biāo)志物，如癌胚抗原、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和細(xì)胞角蛋白19片段聯(lián)合檢測(cè)的臨床意義值得進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)血清S100A2和S100A6蛋白濃度與NSCLC患者臨床病理參數(shù)中腫瘤轉(zhuǎn)移和組織學(xué)類型無(wú)相關(guān)性，其提示血清S100A2和S100A6蛋白可能無(wú)法提示NSCLC患者腫瘤轉(zhuǎn)移狀態(tài)和組織學(xué)類型。血清S100A2和S100A6蛋白濃度均與腫瘤大小有相關(guān)性，盡管機(jī)制尚不清楚，其可能原因與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，尚需要進(jìn)一步研究。

本研究存在不足之處:(1)本研究為單中心研究，納入病例數(shù)目較少，尚需要多中心大量病例研究證實(shí)本研究結(jié)果；(2)本研究并未探討NSCLC患者血清S100A2和S100A6增加精確分子機(jī)制；(3)本研究并未探討血清S100A2和S100A6蛋白濃度和其他NSCLC肺癌分子標(biāo)志物之間的關(guān)系。

綜上所述，NSCLC患者血清S100A2和S100A6蛋白濃度顯著高于健康對(duì)照者，與腫瘤大小密切相關(guān)，血清S100A2和S100A6蛋白均存在良好的診斷NSCLC效能，是潛在NSCLC分子標(biāo)志物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突