賈東旭，唐 燕，周婷婷，王春馳，高 娜，朱迪夫，高其品,3*

（1.吉林大學(xué)生命科學(xué)院，長(zhǎng)春 130012；2.吉林省吉測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司，長(zhǎng)春 130117；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117）

返魂草（senecionis cannabifolii herba, SCH）又名青菀、紫倩等，為菊科千里光屬多年生草本植物，主要分布在我國(guó)東北、西北和華北地區(qū)，具有抗病毒、抗菌、抗急性肺損傷、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、解熱抗胃潰瘍等活性，因此被廣泛應(yīng)用于止咳平喘、肺部急性炎癥、慢性炎癥的治療，返魂草顆粒是由返魂草為原料經(jīng)水提得到的的單方制劑[1-3]；此外，祁海燕等[4]證明了以返魂草提取物為主要成分的返魂草顆粒（肺寧顆粒）可以上調(diào)AECOPD大鼠模型中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）水平，提示返魂草在抗氧化方面具有一定潛力，但目前對(duì)返魂草提取物中的抗氧化成分及其作用機(jī)制的研究還不深入。

酚酸（phenolic acids）是一類含有酚環(huán)的有機(jī)酸，主要存在于蔬果和谷物中，具有抗氧化，抗腫瘤，抗炎，殺菌，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力和保護(hù)心血管等生物功能[5,6]。陳萍紅[7]采用LC-Q-TOF-MS和LC-IT-MS檢測(cè)到肺寧顆粒中的87種成分里面有多種酚酸類成分，并對(duì)檢測(cè)出11種物質(zhì)具有抗炎活性，前期研究鑒定出返魂草提取物醇洗部分含有綠原酸等10種含量較高的酚酸，而目前，對(duì)返魂草中酚酸類物質(zhì)的抗氧化組分和活性還不明確。16HBE細(xì)胞系為永生的人支氣管上皮細(xì)胞，具有正常人呼吸道上皮細(xì)胞的功能，同時(shí)具有良好的遺傳穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于急性肺損傷、肺部炎癥、氧化應(yīng)激等方面的研究[8-9]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用16HBE細(xì)胞系來研究返魂草顆粒的抗氧化活性及作用機(jī)制。

本研究利用1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除實(shí)驗(yàn)，確定返魂草抗氧化部位，并篩選出9種具有抗氧化活性的酚酸類物質(zhì)，在此基礎(chǔ)上更進(jìn)一步研究返魂草的抗氧化活性，為返魂草顆粒在抗氧化和慢性支氣管炎、喘息性支氣管炎、急性呼吸道感染等抗炎方面的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 BSA224S-CW型分析天平（德國(guó)賽多利斯股份有限公司），HH-2水浴鍋（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所），UV-5100型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司），SW-CJ-2D雙人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），MCO-230AICUVL-PC型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本松下公司），iMark酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD），Ti-2型熒光倒置顯微鏡（日本尼康），普力菲爾分型超純水機(jī)（上海富詩(shī)特儀器設(shè)備有限公司）等。

1.2 材料與試劑

1.2.1 材料 返魂草顆粒，由吉林益民堂制藥有限公司提供（產(chǎn)地大興安嶺）。16HBE細(xì)胞系購(gòu)自北納生物創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，資源編號(hào)BNCC338044。

1.2.2 試劑 D101大孔樹脂、DPPH、Vc、無水乙醇、甲醇、95%乙醇、二甲基亞砜（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；3-（4，5-Dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）（MTT）（美國(guó)Sigma公司）；ROS、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；金絲桃苷、綠原酸、異槲皮苷、紫云英苷、原兒茶酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸、隱綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 返魂草提取物的分離 稱取5 g返魂草顆粒，加蒸餾水適量溶解，注入稀釋液至裝有大孔樹脂D101的柱子（2.5 cm×20 cm）中，用蒸餾水洗脫至溶液澄清，洗脫液濃縮，蒸干，得樣I（SCHE-I）。再用60%乙醇洗脫大孔樹脂柱，至溶液澄清，洗脫液濃縮，蒸干，得樣 II（SCHE-II）。

2.2 返魂草抗氧化部分的篩選 按照文獻(xiàn)[10]所述的方法，配制濃度為10～50 μg/mL的Vc溶液以及樣品溶液，以維生素C（Vc）為對(duì)照，分別考察SCHE-I、II清除DPPH自由基的能力。取各對(duì)照品溶液和樣品溶液2 mL與2 mL DPPH乙醇溶液混合搖勻，室溫下放置30 min后測(cè)517 nm處的吸光值，記為A1；取各對(duì)照液和樣品溶液2 mL與2 mL無水乙醇混合搖勻，室溫下放置30 min后測(cè)定吸光度值，記為A2；以2 mL無水乙醇加入2 mL水混合搖勻作為空白調(diào)零，2 mL無水乙醇加2 mL DPPH乙醇溶液混合搖勻測(cè)定吸光度值，記為A0。根據(jù)以下清除率公式計(jì)算清除率：清除率（%）= [1 -（A1-A2）/A0]×100%

以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，清除率SA（%）為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算IC50值。

2.3 SCHE-II中抗氧化組分的篩選 按2.2操作方法，配制濃度為20～100 μg/mL的Vc溶液以及樣品溶液。以Vc為對(duì)照液。測(cè)定和從SCHE-II中鑒別出含量較高的10種酚酸類物質(zhì)清除DPPH自由基的能力。

2.4 16HBE細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立與評(píng)價(jià) 按照文獻(xiàn)[11]所述方法，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，細(xì)胞密度為5～7×104個(gè)/mL，每孔100 μL。根據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道，高溫可以誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，而48.3℃可以可以引起支氣管受損，將其分為空白組和高溫組（分別設(shè)50℃、54℃、58℃、62℃），每個(gè)溫度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h。以細(xì)胞活力為指標(biāo)通過MTT實(shí)驗(yàn)考察高溫對(duì)16HBE的影響，并根據(jù)試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞上清液中SOD活力。

2.5 SCHE-II對(duì)高溫誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞活力的影響 按2.4操作方法，分為空白組、模型組和SCHEII低、中、高劑量組，采用54℃處理模型組和給藥組5 min后分別用37℃的完全培養(yǎng)基和含有SCHE-II濃度為0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、0.75 mg/mL和1 mg/mL的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后測(cè)定細(xì)胞活力。

2.6 16HBE胞內(nèi)活性氧簇水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組與2.5分組方法相同，將細(xì)胞接種于12孔板中，細(xì)胞密度為5×104～7×104個(gè)/mL，每孔1000 μL，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)試劑盒說明書配制濃度為10 μmoL的工作液，每孔加100 μL于37℃避光孵育15～30 min，結(jié)束培養(yǎng)后用PBS清洗細(xì)胞3次，并向板內(nèi)加入PBS溶液50 μL后于10×10倍鏡下觀察熒光強(qiáng)度并拍照。

2.7 樣本制備和抗氧化指標(biāo)測(cè)定 收集細(xì)胞上清液于4℃高速3000 rpm離心10 min，取上清保存于- 20℃，待測(cè)。根據(jù)試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞上清液中T-AOC、GSH水平和抗氧化酶SOD、CAT活力。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS16.0處理數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示結(jié)果。利用T-Test實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)顯著性，當(dāng)P＜0.05時(shí)，數(shù)據(jù)有明顯差異；當(dāng)P＜0.01時(shí)，數(shù)據(jù)有顯著性差異，當(dāng)P＜0.001時(shí)，數(shù)據(jù)有極顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 返魂草提取物對(duì)DPPH自由基清除率的檢測(cè)結(jié)果 返魂草顆粒中水溶性和醇溶性部分（SCHE-I和SCHE-II）對(duì)DPPH自由基清除效果見表1。

表1 SCHE對(duì)DPPH清除率的影響

結(jié)果如表1所示，返魂草顆粒中的水洗提取物SCHE-I在濃度10～50 μg/mL范圍內(nèi)無清除DPPH自由基的效果，而SCHE-II對(duì)DPPH的IC50為34.19%，其濃度為30 μg/mL時(shí)抗氧化能力與10 μg/mL的Vc相當(dāng)。該結(jié)果說明，返魂草顆粒具有抗氧化功能，其中醇溶性部分為有效部位。

3.2 SCHE-II中10種組分單體對(duì)DPPH自由基清除率的檢測(cè)結(jié)果 為了進(jìn)一步分析返魂草中的有效抗氧化組分，選取已經(jīng)被鑒定出的相對(duì)含量較高的10種酚酸類成分，以維生素C（Vc）為對(duì)照，分別考察其對(duì)DPPH自由基清除效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10種單體成分具有抗氧化作用，除紫云英苷單體其他9種單體化合物均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，均與Vc的抗氧化能力相當(dāng)。由此可見，SCHE-II表現(xiàn)出的抗氧化能力是多種組分協(xié)同作用的結(jié)果。

3.3 高溫誘導(dǎo)16HBE氧化應(yīng)激模型的評(píng)價(jià) 根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞上清液中SOD活力篩選建立16HBE細(xì)胞氧化損傷模型的溫度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，高溫建模溫度在50～62℃范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力和SOD活力呈溫度依賴性下降趨勢(shì)。其中，50℃處理細(xì)胞后，16HBE細(xì)胞活力在48 h恢復(fù)到與37℃相當(dāng)，而54℃、58℃和62℃均可以引起16HBE在48 h內(nèi)細(xì)胞活力顯著下降，為了避免過高溫度引起細(xì)胞凋亡，采用54℃為建模溫度。

表2 SCHE-II中各單體成分對(duì)DPPH清除率的影響

表3 高溫對(duì)16HBE細(xì)胞活力及SOD活力的影響（ ，n = 6）

表3 高溫對(duì)16HBE細(xì)胞活力及SOD活力的影響（ ，n = 6）

注：與空白對(duì)照組（37℃）比較，# P＜0.05；## P＜0.01；### P＜0.001

組 別 24 h 48 h OD490 SOD/（U/mL） OD490 SOD/（U/mL）37℃組 0.649±0.041 172.4±10.8 0.681±0.066 160.8±5.1 50℃組 0.560±0.066# 165.8±12.1 0.646±0.080 154.6±4.9 54℃組 0.535±0.085## 132.0±7.4## 0.557±0.052### 120.8±8.4###58℃組 0.467±0.069### 128.1±14.6### 0.397±0.037### 97.4±10.5###62℃組 0.420±0.048### 110.8±8.3### 0.271±0.058### 102.9±2.4###

3.4 SCHE-II對(duì)高溫誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞活力的影響 采用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定SCHE-II對(duì)高溫?fù)p傷后的16HBE細(xì)胞活力的影響。根據(jù)圖1可知，經(jīng)過高溫處理后，模型組細(xì)胞活力較空白組顯著下降（P＜0.01），經(jīng)過SCHE-II治療后，細(xì)胞活力較模型組發(fā)生顯著提升：其中，提取物濃度為1 mg/mL和0.1 mg/mL時(shí)細(xì)胞活力較模型組沒有顯著變化；提取物濃度在0.75～0.25 mg/mL范圍內(nèi)可以有效恢復(fù)由高溫誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞活力下降的問題。根據(jù)細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果，確定SCHE-II作用濃度為0.25 mg/mL，0.5 mg/mL和0.75 mg/mL。

3.5 SCHE-II對(duì)16HBE胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響 為了考察返魂草提取物對(duì)16HBE胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平的影響，進(jìn)行DCFH-DA染色實(shí)驗(yàn)。活性氧分子（reactive oxygen species, ROS）是氧代謝過程的副產(chǎn)品，在氧化應(yīng)激階段，ROS水平顯著增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重大破壞[13]。ROS測(cè)定結(jié)果見圖2，綠色熒光強(qiáng)度代表ROS水平，模型組細(xì)胞數(shù)量較其他組有明顯減少現(xiàn)象，并且在ROS水平較空白組顯著增加；而SCHE-II劑量依賴性降低16HBE細(xì)胞內(nèi)由高溫引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)。3.6 SCHE-II對(duì)16HBE中抗氧化活性物質(zhì)的影響 根據(jù)表3可知，16HBE經(jīng)過54℃高溫培養(yǎng)基孵育5 min后，細(xì)胞的總抗氧化能力（T-AOC）、抗氧化酶SOD和CAT以及抗氧化物還原型谷胱甘肽（GSH）較空白組均有明顯下降（P＜0.05），說明高溫可以誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞氧化水平增加。與模型組相比，16HBE細(xì)胞經(jīng)過SCHE-II孵育24 h后，各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)均以劑量依賴性方式顯著提升，其中SCHE-II對(duì)SOD活力作用最顯著，可以將SOD活力提升至空白組的5倍以上。

圖1 SCHE-II對(duì)高溫誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞活力的影響

圖2 SCHE-II對(duì)16HBE胞內(nèi)ROS水平的影響（100×，比例尺100 μm）

表3 SCHE-II對(duì)16HBE中抗氧化酶和GSH的影響（ ，n = 3）

表3 SCHE-II對(duì)16HBE中抗氧化酶和GSH的影響（ ，n = 3）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01， ### P＜0.001；與模型組比較，△△ P＜0.01，△△△P＜0.001

組 別 T-AOC/mM SOD/（U/mL） CAT/（U/mL） GSH/（μmol/L）空白組 0.118±0.087 159.6±17.9 116.1±10.3 68.4±13.2模型組 0.077±0.121### 123.8±12.5# 88.5±15.0## 58.2±4.20#SCHE-110.25 mg/mL 0.090±0.088△△ 839.3±84.5###△△△ 104.9±16.2△△ 60.6±3.31 SCHE-110.50 mg/mL 0.116±0.113△△△ 984.3±47.7###△△△ 120.1±8.9△△△ 80.7±6.34△△SCHE-110.75 mg/mL 0.125±0.206△△△ 1292.1±21.6###△△△ 132.6±12.8#△△△ 93.5±8.54##△△△

4 討論

本研究通過DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)篩選出返魂草顆粒有效的抗氧化部位為60%乙醇洗脫D101大孔樹脂得到的提取物（SCHE-II），其對(duì)DPPH自由基清除作用的半數(shù)抑制濃度（IC50）為34.19 μg/mL。經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)鑒定，SCHE-II中金絲桃苷、綠原酸、異槲皮苷、原兒茶酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸、新綠原酸等9種含量較高的酚酸組分對(duì)DPPH的IC50均在10～15 μg/mL之間，具有與Vc相當(dāng)?shù)目寡趸钚浴?/p>

SCHE-II在16HBE氧化損傷模型中發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化作用。通過54℃高溫孵育5 min可以使16HBE細(xì)胞活力和SOD活力下降至80%左右，造成細(xì)胞的氧化損傷。SCHE-II以劑量依賴性降低高溫誘導(dǎo)的16HBE胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，顯著增加細(xì)胞的總抗氧化能力，并提升細(xì)胞GSH水平和SOD及CAT活力。GSH是機(jī)體內(nèi)含量最高的非酶性抗氧化物，能夠防止活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷[14,15]，而SOD和CAT作為抗氧化酶在機(jī)體內(nèi)可以通過氧化還原反應(yīng)抑制自由基氧化損傷，達(dá)到預(yù)防氧化應(yīng)激所造成的各種老化性疾病[16]。另外，氧化應(yīng)激還參與細(xì)胞及機(jī)體的炎癥、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等生理活動(dòng)，特別是免疫系統(tǒng)細(xì)胞更易因氧化應(yīng)激遭受損傷,導(dǎo)致機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡的破壞[17,18]，此外，氧化應(yīng)激反應(yīng)是炎癥反應(yīng)的一部分，其會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，進(jìn)而誘導(dǎo)局部炎癥[19,20]。

由此提示，返魂草提取物可有效改善支氣管上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，提升抗氧化酶活力和機(jī)體的自由基清除能力，為明確返魂草抗氧化的功效物質(zhì)基礎(chǔ)以及在抗氧化和抗炎方面的開發(fā)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。