何其英，柳紅芳

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

DN是終末期腎病發(fā)生的主要病因之一[1]，而腎間 質(zhì)纖維化是影響腎功能的關(guān)鍵因素[2]。有研究[3]表明，早期糖尿病大鼠即可出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化的改變。TGF-β1-Smad2/3信號通路在DN腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生中占有重要地位?，F(xiàn)代研究表明，蛋白尿是導(dǎo)致腎臟纖維化發(fā)生的獨(dú)立因素，也是DN進(jìn)展的重要因素。課題組前期臨床研究顯示，芪地糖腎顆粒降低尿蛋白水平與西藥纈沙坦是等效的，但其具體作用機(jī)制不明確[4]。本論文基于TGF-β1-Smad2/3信號通路探討芪地糖腎顆粒防治DN大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 健康雄性Wistar大鼠（SPF清潔級）70只，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（京）2012-0001。芪地糖腎顆粒（熟地黃、生黃芪、芡實(shí)、山萸肉、水蛭、熟大黃等）由涿州東樂制藥公司提供。纈沙坦膠囊（商品名：代文）由北京諾華制藥有限公司提供，規(guī)格80 mg×7片。鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ；美國 Sigma公司）。尿微量白蛋白ELISA 試劑盒（美國 R&D Systems公司）。Anti-TGF beta 1抗體（ab92486）、Anti-Smad2（phospho S467） 抗 體（ab53100）、Anti-Smad3抗體- ChIP Grade（ab28379）（購于美國ABC公司）。

1.2 造模方法 1）大鼠經(jīng)普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，選擇健康、狀態(tài)良好并檢測血糖正常的大鼠列入觀察。2）按隨機(jī)分組法分為對照組10只、造模組60只。所有組禁食12 h，將造模組大鼠予單次腹腔注射STZ 55 mg/kg（STZ 臨用前溶解于0.1 mol/L、pH4.5 的檸檬酸鹽緩沖液），而對照組大鼠腹腔注射等體積上述緩沖液。3）注射STZ 72 h后，尾靜脈采血，以血糖高于16.7 mmol/L者，視為造模成功。

1.3 分組與給藥

1.3.1 分組 將造模組中成模大鼠隨機(jī)平均分為6組，即對照組，模型組，中藥芪地糖腎顆粒高、中、低劑量組，纈沙坦組（代文組）。

1.3.2 給藥 各組大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食進(jìn)水，按照體質(zhì)量喂以同容積的藥物，中藥高、中、低劑量組用CMC以5.24 g/kg、2.62 g/kg和1.31 g/kg的濃度配制成三種不同濃度的藥液給藥；代文組按8 mg/kg，等量溶液給藥；對照組及模型組予等量的CMC液。給藥方式為灌胃給藥，1次/d，于上午進(jìn)行，連續(xù)給藥12周。

1.4 標(biāo)本采集 大鼠于給藥后第12周末禁食不禁水10 h，以0.33 mL/100g腹腔注射10%水合氯醛麻醉動物。腹主動脈取血，離心后取血清，- 80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｈ∮覀?cè)腎臟，沿冠狀面剖開，部分放入2.5%的戊二醛溶液中固定，其余放入4%的甲醛溶液固定12～24 h。取左側(cè)腎臟放入凍存管中- 80℃冰箱保存。

1.5 檢測指標(biāo) 1）大鼠一般狀態(tài)；2）尿液指標(biāo)：24 h尿微量白蛋白；3）組織病理學(xué)指標(biāo)：將腎組織切片行HE、Masson染色，光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化；4）Western-Blot法檢測腎組織中纖維化相關(guān)因子TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)運(yùn)用拉依達(dá)準(zhǔn)則（均值±3倍標(biāo)準(zhǔn)差）對離群值進(jìn)行剔除，所有結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。均值比較采用單因素方差分析或兩因素重復(fù)測量方差分析方法，方差齊時(shí)用LSD法，方差不齊時(shí)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換或使用Dunnett’s T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況 對照組大鼠一般毛色光亮，飲食水正常，精神狀態(tài)佳，靈活易動；模型組大鼠毛色逐漸失去光澤，飲食水量逐漸增加，大小便量增加，大鼠活動遲緩，精神不振，身體靈活度降低，體型逐漸增胖。與模型組相比，芪地糖腎顆粒組大鼠精神狀態(tài)較好，毛色較亮，靈活度增加。

2.2 各組24 h MAU的比較 見表1、圖1。

表1 各組24 h MAU的比較（ ，n = 8） μg/24 h

表1 各組24 h MAU的比較（ ，n = 8） μg/24 h

注：與對照組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與代文組比較，▲P＜0.05

組 別 0周 4周 8周 12周對照組 0.77±0.43 0.74±0.21 0.63±0.32 0.82±0.28模型組 2.10±0.81##2.49±0.97 3.34±1.42##5.48±1.88##代文組 2.14±0.67##2.08±0.94 3.20±1.48 4.45±1.73△△高劑量組 2.08±0.53##2.80±0.58 3.20±0.96 2.27±0.83△△▲中劑量組 2.12±0.46##2.77±1.89 2.65±1.57 2.26±1.08△△▲低劑量組 2.19±0.61##3.67±1.86 3.86±1.61 2.91±1.61△△

圖1 給藥前后第12周大鼠24 h MAU變化的直方圖

2.3 組織形態(tài)學(xué)改變 1）HE染色：與對照組相比，模型組腎臟的腎小球系膜基質(zhì)增多或毛細(xì)血管基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，伴肥大擴(kuò)張；與模型組相比，芪地糖腎顆粒劑中、低劑量組動物腎臟腎小管上皮細(xì)胞胞漿空亮、呈空格樣病變發(fā)生率有降低，且中劑量組動物腎臟病變發(fā)生率降低更為明顯，病變程度亦有降低（見圖2）。2）Masson染色：所有實(shí)驗(yàn)動物Masson染色腎臟組織切片膠原纖維染色均未見明顯異常，與對照組動物相比，模型組和給藥各組腎臟均未見腎小球及間質(zhì)纖維增生（見圖3）。

圖2 1.對照組；2.模型組；3.代文組；4.高劑量組；5.中劑量組；6.低劑量組

圖3 1.對照組；2.模型組；3.代文組；4.高劑量組；5.中劑量組；6.低劑量組

2.4 各組腎組織TGF-β1、Smad2及Smad3的灰度值比較 見表2。

表2 各組腎組織TGF-β1、Smad2及Smad3的灰度值比較（ ，n = 3）

表2 各組腎組織TGF-β1、Smad2及Smad3的灰度值比較（ ，n = 3）

注：與對照組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 TGF-β1 Smad2 Smad3對照組 0.38±0.07 0.21±0.09 0.18±0.08模型組 0.64±0.04## 0.55±0.12# 0.42±0.13#代文組 0.38±0.08△ 0.37±0.12 0.27±0.05高劑量組 0.35±0.04△△ 0.39±0.04 0.25±0.06中劑量組 0.50±0.11 0.35±0.18 0.30±0.08低劑量組 0.43±0.09△ 0.29±0.11 0.25±0.10

3 討論

腎臟間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟?。–KD）發(fā)展慢腎衰的共同通路[5]，主要病理表現(xiàn)為腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增加以及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過渡蓄積[6]，從而導(dǎo)致瘢痕組織形成和蛋白尿產(chǎn)生[7]。TGF-β1被證實(shí)是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的重要因子[8]。Smads蛋白是參與TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的下游蛋白，其中Smad2、Smad3屬于Smads家族中的受體活化性蛋白，二者調(diào)節(jié)受阻，機(jī)體的結(jié)締組織生長因子及血管內(nèi)皮因子表達(dá)增加，可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化分化，從而促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化[9]。敲除Smad3基因的單側(cè)輸尿管結(jié)扎的大鼠模型中，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的發(fā)生和細(xì)胞外基質(zhì)的堆積受到抑制[10]。

芪地糖腎顆粒是由熟地黃、生黃芪、芡實(shí)、山萸肉、水蛭、熟大黃、等組成。方中熟地黃為君藥，甘溫，補(bǔ)腎填精，“峻補(bǔ)”真陰。陳銀鳳等[11]認(rèn)為腎臟纖維化治療可以從腎藏精理論入手。劉道剛[12]在探討生熟地緩解腎間質(zhì)纖維化的作用及機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)生熟地組可以下調(diào)TGF-β1水平來緩解腎間質(zhì)纖維化。臣藥黃芪主要活性成分黃芪甲苷，有研究表明可以抑制α-SMA和Ⅲ型膠原的表達(dá)[13]。芡實(shí)、山萸肉為佐，酸澀收斂、補(bǔ)腎固澀，助君藥填補(bǔ)真陰。董文華[14]在探討芡實(shí)在糖尿病腎病中對STZ腹腔注射造模大鼠的TGF-β1的影響中發(fā)現(xiàn)，中藥芡實(shí)組大鼠腎臟組織TGF-β1的表達(dá)較模型組低（P＜0.05），可以緩解糖尿病腎病大鼠的進(jìn)展。熟大黃，下瘀血，破癥瘕，制用瀉下作用減弱，活血降濁之力加大，配伍水蛭，可以疏通精氣疏布五臟的通路，起到祛邪復(fù)精的目的。郭會敏等[15]認(rèn)為水蛭可抑制纖維化因子TGF-β1和CTGF的表達(dá)、阻止細(xì)胞周期、促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡等作用來抑制腎小球系膜細(xì)胞增生和肥大。本研究用大劑量STZ腹腔注射形式復(fù)制DN大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎組織中 TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA的表達(dá)上調(diào)，中藥治療組大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA表達(dá)下調(diào)，而且大鼠24 h尿微量白蛋白水平顯著下降，提示芪地糖腎顆粒可以降低尿蛋白能水平，并且可能通過TGF-β1-Smad2/3通路來下調(diào)TGF-β1和α-SMA的水平，從而能防治糖尿病腎病間質(zhì)纖維化的。