姜洋洋 侯生珍 王志有

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810000)

GH基因是提高動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)基因，不同的動(dòng)物或同一種動(dòng)物在不同生產(chǎn)水平下生長(zhǎng)速度有顯著差異，這與其生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)水平緊密相關(guān)。GH基因生物學(xué)功能是促生長(zhǎng)，動(dòng)物通過(guò)自己的生長(zhǎng)軸內(nèi)分泌系統(tǒng)，從下丘腦直接分泌生長(zhǎng)激素，釋放激素和生長(zhǎng)抑素到垂體，促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌，通過(guò)血液循環(huán)和肝臟表面的生長(zhǎng)激素受體結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，通過(guò)對(duì)二聚體的構(gòu)象變化，促進(jìn)肝臟器官的胰島素生長(zhǎng)[1-2]。生長(zhǎng)激素是整個(gè)生長(zhǎng)軸上最重要的激素，是動(dòng)物生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，刺激骨骼和軟骨的發(fā)育,加速脂肪分解代謝,促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[3-4]。生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝，糖的轉(zhuǎn)化和氧化，蛋白質(zhì)合成和氨基酸運(yùn)輸，脂肪組織的合成需要酶的協(xié)助，生長(zhǎng)激素可能會(huì)干擾脂肪酶的合成，轉(zhuǎn)錄抑制酶的活性，從而降低脂肪組織的合成速度[5]。從分子營(yíng)養(yǎng)的角度來(lái)看，動(dòng)物個(gè)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求是不同的，動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用是否受到基因表達(dá)和調(diào)控的影響，研究不同蛋白質(zhì)水平對(duì)綿羊生長(zhǎng)發(fā)育及GH分泌、基因表達(dá)的作用，闡明飼料中蛋白質(zhì)水平對(duì)綿羊生長(zhǎng)發(fā)育及GH分泌、基因表達(dá)的影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)時(shí)間：2018年8月～2019年3月。

試驗(yàn)地點(diǎn)：試驗(yàn)?zāi)秆蛉焉锴捌诜拍溜曫B(yǎng)地點(diǎn)在剛察縣沙流河鎮(zhèn)尕曲村，妊娠后期舍飼飼養(yǎng)地點(diǎn)在海東市樂(lè)都金元牧業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇60 只年齡、胎次、體況相近的藏母羊；對(duì)試驗(yàn)?zāi)秆蛲诎l(fā)情處理，確保在同一時(shí)間發(fā)情期受胎；母羊妊娠前期(0～85 d)在天然草場(chǎng)放牧飼養(yǎng)；妊娠后期（86～150 d）將母羊隨機(jī)分為2 組，每組30 只，進(jìn)行全舍飼飼養(yǎng)，分別飼喂消化能相同而蛋白水平為7.5%和13.5%的日糧。母羊分娩后，每組選取3 只初生羔羊進(jìn)行屠宰，采集瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、十二指腸、空腸、回腸、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、肌肉等組織樣，樣品液氮保存待測(cè)。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)?zāi)秆虿捎们傲邢俅纪诎l(fā)情處理(1 ml/只，2次，間隔12 d），第二次處理后按1∶10的比例投放種公羊進(jìn)行集中配種。母羊妊娠前期(0～85 d)然草場(chǎng)放牧飼養(yǎng)，放牧草場(chǎng)為高寒草甸草場(chǎng)，早晨7:00 出牧，晚上20：00歸牧。母羊妊娠后期（86～150 d）全舍飼飼養(yǎng)，試驗(yàn)開始之前對(duì)圈舍進(jìn)行消毒處理，試驗(yàn)?zāi)秆蛴诿刻煸缟?：00和下午18:00飼喂全混合日糧2次，自由采食，自由飲水；每天對(duì)料槽和水槽進(jìn)行清洗，圈舍每周進(jìn)行消毒，保持圈舍衛(wèi)生、干燥、通風(fēng)；試驗(yàn)羊定期進(jìn)行接種防疫。

1.4 試驗(yàn)飼糧

參照NRC(2013)綿羊營(yíng)養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)和我國(guó)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》，結(jié)合藏羊體重和營(yíng)養(yǎng)需要特點(diǎn)，進(jìn)行藏母羊妊娠后期飼糧配方設(shè)計(jì)，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 總RNA的提取

將采集的組織樣品采用液氮研磨的方法充分粉碎，使用北京天根生化科技有限公司的總RNA 提取試劑盒并按照操作步驟提取樣品RNA。總RNA濃度和純度采用核酸定量?jī)x進(jìn)行檢測(cè)，確?？俁NA 濃度在100 ng/μl 以上，A260/280 和A260/230 的OD 值在2～2.5 之間。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性或是否有蛋白質(zhì)和DNA污染。

1.5.2 RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA

利用北京天根生化科技有限公司FastKing RT kit cDNA的第一鏈合成試劑盒將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。所有的操作都是在冰上進(jìn)行的，實(shí)驗(yàn)室設(shè)備必須先用RNase固相去除器進(jìn)行處理。

1.5.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

利用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/網(wǎng)站設(shè)計(jì)定量PCR 引物，確定引物序列，以GAPDH 為內(nèi)參基因，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行引物合成引物序列，產(chǎn)物長(zhǎng)度及退火溫度如表2所示。

表2 引物信息

1.5.4 熒光定量PCR擴(kuò)增

使用北京天根生化科技有限公司的SuperReal PreMix Color(SYBR Green)試劑盒，利用Rotor-Gene Q 實(shí)時(shí)定量PCR 儀測(cè)定目標(biāo)基因在羔羊不同部位組織中的mRNA 表達(dá)量，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。反應(yīng)條件中預(yù)變性、變性及退火的循環(huán)次數(shù)為40。具體反應(yīng)體系和條件見表3和表4。

表3 PCR反應(yīng)體系

表4 PCR反應(yīng)條件

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

將試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 GH 基因在羔羊不同內(nèi)臟器官及肌肉組織中表達(dá)量的比較

由表5和圖1可見，試驗(yàn)Ⅱ組初生羔羊心臟、肝臟、肺組織中GH基因的表達(dá)量明顯高于Ⅰ組(P＜0.05)。

表5 GH基因在羔羊不同內(nèi)臟器官及肌肉組織中表達(dá)量

圖1 GH基因在羔羊不同內(nèi)臟器官及肌肉組織中表達(dá)量

2.2 GH基因在初生羔羊不同胃腸道中表達(dá)量比較

由表6 和圖2 可見，初生羔羊瓣胃、皺胃、空腸中GH基因的表達(dá)量，試驗(yàn)Ⅱ組顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)，而瘤胃、十二指腸和回腸中GH基因的表達(dá)量，Ⅰ組和Ⅱ組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 藏母羊妊娠后期日糧蛋白水平對(duì)初生羔羊內(nèi)臟器官及肌肉GH基因表達(dá)量的影響

GH基因是調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中生長(zhǎng)激素生長(zhǎng)和分泌的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)肌肉和骨骼生長(zhǎng)，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，提高飼料報(bào)酬的作用。GH 基因存在于羔羊各個(gè)內(nèi)臟器官和胃腸道及肌肉組織，其表達(dá)有顯著差異。章玲玲等[6]對(duì)家禽心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和肌肉中GH 基因表達(dá)量進(jìn)行了研究，證明GH 基因在肌肉組織表達(dá)量最低，肺中的表達(dá)量最高。張玲等[7]在研究不同日糧營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)番鴨GH基因在肌肉組織中表達(dá)情況的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在番鴨早期生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，GH 基因表達(dá)會(huì)因日糧營(yíng)養(yǎng)水平的不同而出現(xiàn)差異。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在兩種蛋白水平下，腎臟和肺中GH基因的表達(dá)量分別為最高和最低，這與前人的研究結(jié)果有相似之處，具有區(qū)別的原因可能是所選試驗(yàn)物種的差異亦或營(yíng)養(yǎng)水平設(shè)置梯度的差異。藏母羊妊娠后期日糧蛋白水平為13.5%時(shí)，初生羔羊心、肝、肺組織中GH 基因的表達(dá)量明顯高于7.5%蛋白組(P＜0.05)，說(shuō)明妊娠后期提高藏母羊日糧蛋白水平能顯著提高胎兒內(nèi)臟和肌肉組織的生長(zhǎng)發(fā)育，此結(jié)果與張玲的研究結(jié)果一致。

表6 GH基因在羔羊不同胃腸道中表達(dá)量

圖2 GH基因在羔羊不同胃腸道中表達(dá)量

3.2 藏母羊妊娠后期日糧蛋白水平對(duì)初生羔羊胃腸道GH基因表達(dá)量的影響

腸道的生長(zhǎng)發(fā)育受多種因素的影響，如遺傳、養(yǎng)分、環(huán)境和神經(jīng)內(nèi)分泌等。腸道具有兩方面作用，既作為消化和吸收養(yǎng)分物質(zhì)的重要器官，又是保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的先天性屏障。十二指腸是重要的消化器官，擔(dān)負(fù)著消化和吸收機(jī)體所需的大多部分養(yǎng)分物質(zhì)的功能。因此，十二指腸發(fā)育的狀況在很大程度上決定動(dòng)物的生長(zhǎng)速度[8]。殷新平[9]對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)激素基因全長(zhǎng)進(jìn)行克隆測(cè)序，分析GH 在組織中的差異性表達(dá)，結(jié)果表明GH基因只在垂體中特異表達(dá)，而在肌肉、脾臟、脂肪、腎臟、胃、盲腸、心臟、頭腎、精巢、腸、鰓、肝臟、魚皮和腦這14 個(gè)組織中均未檢測(cè)到表達(dá)。曹運(yùn)長(zhǎng)等研究表明，垂體中GH 表達(dá)量與腎臟相比差異極顯著，垂體GH 基因表達(dá)量較高與藍(lán)太陽(yáng)魚表達(dá)結(jié)果一致，在胃中檢測(cè)不到表達(dá)。胃的生長(zhǎng)發(fā)育也離不開GH的調(diào)節(jié)，前人實(shí)驗(yàn)已相繼表明在大鼠、兔子和人的胃中有GHr 基因的表達(dá)[10]。Nagano M(1995)用RT-PCR 結(jié)合Southern 雜交的方法也檢測(cè)出在人、大鼠和兔子胃組織中有GHr 的表達(dá)，以上研究結(jié)果表明，GH 對(duì)胃的生長(zhǎng)有重要的調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，藏母羊妊娠后期日糧蛋白水平為13.5%時(shí)，初生羔羊的瓣胃、皺胃、空腸GH基因表達(dá)量均顯著高于7.5%蛋白組(P＜0.05)，而瘤胃、十二指腸和回腸中GH基因的表達(dá)量，7.5%蛋白組和13.5%蛋白組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，藏母羊妊娠后期日糧蛋白水平為13.5%時(shí)，初生羔羊心臟、肝臟、肺、瓣胃、皺胃、空腸中GH基因的表達(dá)量明顯高于7.5%蛋白組(P＜0.05)，妊娠后期提高藏母羊日糧蛋白水平能顯著提高胎兒內(nèi)臟器官、肌肉組織和胃腸道的生長(zhǎng)發(fā)育。