魏 霞, 耿 雪，劉 娜，祝清芬

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101）

2017版的《中國藥典分析檢測技術(shù)指南》細菌內(nèi)毒素檢查法中對于直接接觸供試品的器具（稱量、溶解、稀釋、注射等）做了應(yīng)無菌、無熱原的要求，并未對材質(zhì)有禁止規(guī)定；方法對使用塑料器械的要求為：應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械。日常熱原檢驗工作中，各實驗室常會使用一次性無熱原注射器，樣品稀釋可能會使用無熱原的離心管或細胞培養(yǎng)瓶作為容器具；在細菌內(nèi)毒素（內(nèi)毒素）檢查過程中，樣品和標(biāo)準品的稀釋也可能會使用塑料容器具。為明確目前一次性無菌注射器和塑料制品是否對細菌內(nèi)毒素存在吸附，無吸附時間窗是多少而開展本次研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PKF96 型細菌內(nèi)毒素測定儀（美國ACC公司）；潔凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ZH-2 BLENDER振蕩儀（天津藥典標(biāo)準儀器廠）。

1.2 材料

動態(tài)濁度法鱟試劑（湛江安度斯，批號：1809270）；細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201784）；細菌內(nèi)毒素用水（湛江安度斯，批號：1810170）；一次性無熱原槍頭（Axygen）；一次性無菌注射器（規(guī)格5，10 ml，山東新華安得醫(yī)療用品有限公司，批號：180329，失效日期202103，筒身為聚丙烯，密封圈為合成橡膠，執(zhí)行標(biāo)準為企標(biāo)Q/AD 3151515-2015）；10 ml無熱原塑料離心管（管身、瓶蓋均為聚丙烯，Corning公司）；25 cm2細胞培養(yǎng)瓶（矩形，斜頸，透氣蓋，瓶身、瓶蓋均為聚苯乙烯材質(zhì)，Corning公司）。

2 方法與結(jié)果

本文依據(jù)《中國藥典》2015年版第四部通則1143 細菌內(nèi)毒素檢查法[1]（方法2：光度測定法）建立標(biāo)準曲線，按建立的方法對各注射器和塑料容器進行與內(nèi)毒素共存后的定量檢測。

2.1 標(biāo)準曲線的建立

用細菌內(nèi)毒素檢查用水將細菌內(nèi)毒素標(biāo)準品依次稀釋至2，0.5，0.125，0.03125 EU/ml，每個濃度取0.1 ml加至3支反應(yīng)試管中，同時取細菌內(nèi)毒素用水0.1 ml加至2支反應(yīng)試管中作為陰性對照。各管依次加入0.1 ml復(fù)溶好的動態(tài)濁度法鱟試劑（取1支，加1.25 ml細菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶），充分混合放入預(yù)熱到37.0±0.1 ℃的 PKF96型細菌內(nèi)毒素測定儀中，混勻時避免產(chǎn)生氣泡，反應(yīng)時間為3600 s，檢測波長為660 nm。反應(yīng)結(jié)束后以各濃度的平均反應(yīng)時間對數(shù)值（LgT）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)細菌內(nèi)毒素濃度對數(shù)值（LgC）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線（見表1）。由表1可得標(biāo)準曲線方程：LgT＝2.88-0.263 LgC（r＝-0.993）（|r|＞0.980），平行管之間的變異系數(shù)均小于10 %，陰性對照的反應(yīng)時間大于標(biāo)準曲線最低濃度的反應(yīng)時間，表明標(biāo)準曲線符合規(guī)定。

表1 標(biāo)準曲線可靠性試驗結(jié)果

2.2 一次性無菌注射器與標(biāo)準內(nèi)毒素共存

本次試驗選取5，10 ml注射器各2支，選取30，120 min 2個共存時間點，制備0.5 EU/ml的標(biāo)準內(nèi)毒素，根據(jù)注射器的量程，使內(nèi)毒素溶液均勻充滿注射器，分別在第1，2個時間點取樣，樣本分為兩種混勻形式，第一種為未混勻前將溶液取出另置，加樣前混勻30 s（外混勻），第二種為注射器內(nèi)溶液直接混勻30 s加樣（內(nèi)混勻）。兩種規(guī)格注射器同法操作，每個檢測時點均取待測液0.1 ml，加入0.1 ml動態(tài)濁度法鱟試劑中，并同時做標(biāo)準內(nèi)毒素對照，標(biāo)準內(nèi)毒素對照盛放于無熱原的玻璃試管內(nèi)。檢測條件及注意事項同標(biāo)準曲線的建立。結(jié)果見表2。

表2結(jié)果顯示，各樣本細菌內(nèi)毒素的回收率在50 %～200 %之間，陰性對照的檢測值小于標(biāo)準曲線最低點的檢測值。表明共存放置2 h后，注射器內(nèi)細菌內(nèi)毒素濃度基本無變化。

2.3 塑料存儲容器與內(nèi)毒素共存

取離心管和細胞培養(yǎng)瓶，制備0.25 EU/ml的標(biāo)準內(nèi)毒素，根據(jù)其各自的容積，離心管、細胞培養(yǎng)瓶分別盛放10，30 ml標(biāo)準細菌內(nèi)毒素溶液，垂直放置于室溫的凈化工作臺內(nèi)，旋緊蓋子保存，分別于2，5，7，30，48 h 5個時間點取樣，，樣本分為兩種混勻形式，操作同2.2，離心管和細胞培養(yǎng)瓶同法操作，每個時間點均取待測液0.1 ml，加入0.1 ml動態(tài)濁度法鱟試劑中。同時做標(biāo)準內(nèi)毒素對照，標(biāo)準內(nèi)毒素對照盛放于無熱原的玻璃試管內(nèi)，但只在48 h試驗結(jié)束時做檢測，檢測條件及注意事項同2.1。結(jié)果見表3、圖1。結(jié)果表明，標(biāo)準細菌內(nèi)毒素與兩種材質(zhì)不同的塑料存儲容器共存后，48 h內(nèi)，細菌內(nèi)毒素的回收率均在50 %～200 %之間，7 h內(nèi)均未見標(biāo)準內(nèi)毒素濃度的降低；離心管與細菌內(nèi)毒素共存后，在30 h、48 h兩個時點，離心管、玻璃管內(nèi)渦旋混勻，細菌內(nèi)毒素的濃度均呈下降趨勢；細胞培養(yǎng)瓶與細菌內(nèi)毒素共存48 h后，細菌內(nèi)毒素濃度未見明顯變化。

表2 一次性無菌注射器與標(biāo)準細菌內(nèi)毒素共存后的內(nèi)毒素含量

3 討論

一般實驗室常用的吸頭、移液管等都使用聚丙烯材質(zhì)，細胞培養(yǎng)板/細胞培養(yǎng)瓶一般采用聚苯乙烯材質(zhì)，而塑料離心管可能會采用多種材質(zhì)。目前，一次性使用無菌注射器執(zhí)行的標(biāo)準為GB 15810-2001，該標(biāo)準對于筒身的材質(zhì)要求為聚丙烯、聚苯乙烯或聚乙烯/丙烯腈共聚物，活塞為高質(zhì)量的天然橡膠，表面涂以聚二甲基硅氧烷進行潤滑。經(jīng)調(diào)研，目前市場上一次性無菌注射器筒身多采用聚丙烯，本次試驗采用的離心管也是聚丙烯材料，該材料的特點是半透明，為結(jié)晶性塑料，化學(xué)及溫度穩(wěn)定性較好，但在低溫下會變脆，細胞培養(yǎng)瓶采用的是聚苯乙烯材料。有研究指出，一次性器具應(yīng)選擇聚苯乙烯，盡可能不要用聚丙烯材料，它會加劇內(nèi)毒素的損耗（吸附內(nèi)毒素）。本研究依據(jù)檢驗過程中的樣品與注射器、塑料容器的共存情況，評價不同塑料制品對細菌內(nèi)毒素的吸附作用，為檢驗工作提供數(shù)據(jù)。

表3 塑料存儲容器與標(biāo)準細菌內(nèi)毒素共存后的內(nèi)毒素含量

圖1 塑料存儲容器與標(biāo)準內(nèi)毒素共存后的內(nèi)毒素變化趨勢

內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細胞死亡后解體釋放出的脂多糖類物質(zhì)，對塑料等疏水性強的物質(zhì)有很強的吸附能力，同時對不同材料也有很高的親和力，如金屬、陶瓷[2]、二氧化硅、鋯[3]、丙烯酸樹脂[4]，甚至鈦和鈦合金[5]等。有文獻[6]指出細菌內(nèi)毒素實驗中所使用的一次性吸頭、酶標(biāo)板等塑料制品，一定要使用無菌、無內(nèi)毒素、無吸附作用且對內(nèi)毒素實驗不存在干擾的產(chǎn)品。聚丙烯材料制成的槍頭對內(nèi)毒素的吸附也被公認為是干擾內(nèi)毒素檢查的因素之一，因此，任何聚丙烯材料的試驗器材不可用于內(nèi)毒素的檢查；但有實驗證明由聚丙烯材料制成的加樣吸頭，與實驗溶液的短暫接觸對內(nèi)毒素的回收沒有影響[7]。

常規(guī)檢驗操作中，存于玻璃試管中的標(biāo)準內(nèi)毒素放置超過5 min及更長時間，加樣前必須渦旋30 s后加樣，以保證檢驗結(jié)果的準確性。本次研究采用了容器內(nèi)、外兩種模式進行混懸后加樣，于細胞培養(yǎng)瓶中共存放置48 h后，未混懸取出的標(biāo)準內(nèi)毒素，其濃度與管內(nèi)濃度未見明顯差異，可見標(biāo)準內(nèi)毒素的吸附較少。根據(jù)試驗結(jié)果，聚苯乙烯較聚丙烯材質(zhì)，對細菌內(nèi)毒素的吸附較少。實際檢驗過程中，可采用聚苯乙烯材料的無熱原稀釋器具進行熱原、細菌內(nèi)毒素檢查用樣品的稀釋，稀釋后也應(yīng)盡快使用。在熱原檢查中，采用一次性無菌注射器抽取樣品溶液后，應(yīng)盡快或于2 h內(nèi)完成注射。