李浩然，田芳芳

（1.漯河市藥品檢測檢驗中心，河南 漯河 462008；2.漯河市第二人民醫(yī)院消毒供應(yīng)中心，河南 漯河462000）

二維葡醛內(nèi)酯片是由葡萄糖醛酸內(nèi)酯、維生素C、維生素B1及輔料組成的復(fù)方類藥物，臨床主要用于急慢性肝炎及肝臟中毒的輔助治療。在其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]中維生素C的含量測定采用滴定分析法，維生素B1含量測定采用高效液相色譜法（HPLC），實驗操作繁瑣費時。我們采用高效液相色譜法同時測定處方中的維生素C、維生素B1的含量，方法簡單、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010c型全自動高效液相色譜儀（LC solution 1.22 sp1色譜工作站，日本島津）；CPA-225D型電子分析天平（德國賽多利斯）；FE20/EL20型pH計（瑞士梅特勒）。

1.2 試藥

維生素C對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100425-201103）；維生素B1對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100390-201505）；二維葡醛內(nèi)酯片（河北東風(fēng)藥業(yè)，批號：17011301，17011302，17051701）；乙腈（色譜純），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent氨基鍵和硅膠色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈 0.04 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）（66:34）；檢測波長：249 nm；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品儲備液 分別精密稱取維生素C對照品100 mg，維生素B1對照品 20 mg，置入50 ml量瓶，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液。

2.2.2 混合對照品溶液 精密吸取混合對照品儲備液5 ml，置入100 ml量瓶，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml中含維生素C 0.1 mg、維生素B10.02 mg的溶液，作為混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取二維葡醛內(nèi)酯片20片，除去糖衣后，精密稱定，置研缽中研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于維生素C 10 mg、維生素B12 mg），置入100 ml量瓶，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液 按處方比例精密稱取輔料0.26 g，再按供試品溶液的稀釋方法配制成陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取2.2項下混合對照品溶液、陰性對照溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果輔料對兩種成分含量測定無影響，維生素C和維生素B1分離度符合規(guī)定，說明色譜條件具有良好的專屬性（見圖1）。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 專屬性試驗HPLC圖譜

取2.2.1項下混合對照品儲備液，分別加流動相稀釋制成每1 ml中含維生素C 0.4，0.2，0.1，0.05，0.025 mg、維生素B10.08，0.04，0.02，0.01，0.005 mg的系列對照品溶液，照2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為：維生素C：Y=2.7823×107C1-75 154，r=1.0000；維生素B1：Y=1.8467×107C2-23 408，r=0.9996。

結(jié)果表明維生素C在0.4～0.025 mg/ml，維生素B1在0.08～0.005 mg/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取2.2.2項下混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次維生素C峰面積RSD為0.22 %（n=5），維生素B1峰面積RSD為0.37 %（n=5），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取二維葡醛內(nèi)酯片（批號：17011301），按2.2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下方法，按外標(biāo)法以峰面積分別計算維生素C、維生素B1的含量。結(jié)果維生素C含量RSD為 0.24 %，維生素B1含量RSD為0.32 %，表明本法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

按2.2.3項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，維生素C平均峰面積為2 739 987，RSD為0.59 %（n=6），維生素B1平均峰面積為 330 960，RSD為0.63 %，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 定量限

取2.2.3項下溶液逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以信噪比為S/N=10:1測得定量限。維生素C定量限為5.4 ng/ml，維生素B1定量限為12.8 ng/ml。

2.9 回收率試驗

將對照品按處方量80 %、100 %、120 %和陰對照溶液混合配制模擬樣品共9份，照2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣，按外標(biāo)法分別計算維生素C、維生素B1的回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗（n=9）

2.10 樣品測定

取二維葡醛內(nèi)酯片（批號：17011301，17011302，17051701），分別按2.2.3項下方法制備供試品溶液，每批3份，按2.1項下方法測定，結(jié)果見表2。

3 討論

傳統(tǒng)方法維生素C、維生素B1采用C18色譜柱進(jìn)行含量測定[2-8]，由于維生素C、維生素B1極性較強(qiáng)，其在C18色譜柱上幾乎不保留，樣品主成分峰、溶劑峰、雜質(zhì)峰很難實現(xiàn)完全分離。本文采用氨基鍵合硅膠作為固定相，用乙腈 0.04 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5）（66:34）為流動相，能克服維生素C、維生素B1在C18色譜柱上保留不足的問題，有效地分離樣品及其中的雜質(zhì)峰，且該方法前處理簡單，有良好的回收率，可快速測定樣品中維生素C、維生素B1的含量。用流動相進(jìn)行含量測定時，增加乙腈的比例，相應(yīng)地維生素B1的保留時間變長，而維生素C的保留時間縮短，這是由于維生素C和維生素B1酸堿性質(zhì)不同導(dǎo)致，且流動相偏酸性，可能會使固定相帶負(fù)電荷的氨基官能團(tuán)質(zhì)子化，色譜柱使用一段時間后柱效下降，需要用5～10倍含0.5 %～1.0 % NH3的流動相進(jìn)行活化。

表2 樣品測定結(jié)果