房紹英，邵華榮，黃艷妮，程艷玲*，江 婷

（1.山東省藥學科學院，山東 濟南 250101；2.山東省分析測試中心，山東 濟南 250101）

甲巰咪唑為臨床常用抗甲狀腺藥物，用于各種類型的甲狀腺功能亢進癥，因口服給藥可出現(xiàn)血液系統(tǒng)異常等不良反應[1-2]，目前已開發(fā)甲巰咪唑軟膏，通過局部用藥來提高藥物療效、降低不良反應。復方甲巰咪唑軟膏的有效藥物成分是甲巰咪唑和氫化可的松，具有抑制過氧化酶和碘吸收的雙重作用，可阻止甲狀腺激素合成，有利于增強對甲亢的控制[3]。目前對復方甲巰咪唑軟膏的研究多集中于作用機制研究及臨床療效觀察[4-5]，尚無對復方甲巰咪唑軟膏的臨床前藥動學研究。本文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）及高效液相色譜法（HPLC）測定大鼠血清及甲狀腺組織中甲巰咪唑濃度，研究復方甲巰咪唑軟膏在大鼠體內(nèi)的藥動學性質(zhì)，了解甲巰咪唑的體內(nèi)過程及復方與單方制劑主要藥動學參數(shù)的差異，為臨床合理應用復方甲巰咪唑軟膏提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器（美國安捷倫）；Agilent1200型高效液相色譜儀，配備Agilent 6430型三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜檢測器（美國安捷倫）；LG10-2.4A型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；XK96-A型快速混勻器（姜堰新康醫(yī)療器械公司）；N-EVAP型氮吹儀（Organomation Associates Inc.）。

1.2 藥品與試劑

甲巰咪唑?qū)φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號：0030-9703）；對乙酰氨基酚標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100018-200107）；復方甲巰咪唑軟膏[山東省藥學科學院，甲巰咪唑5 %（w/w），氫化可的松0.5 %（w/w），批號：070318-4]；甲巰咪唑軟膏（山東省藥學科學院，甲巰咪唑5 %（w/w），批號：070318-2）；甲醇，乙腈，甲酸，乙酸銨（色譜純，美國Tedia公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

Wistar大鼠，240只，雌雄各半，由山東大學實驗動物中心提供。大鼠購進后進行1周預飼養(yǎng)，用于試驗時體重200～240 g。動物均飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境，室溫19～26 ℃，濕度40 %～70 %，日溫差≤4 ℃，換氣次數(shù)8～10次/h，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。大鼠用金屬籠飼養(yǎng)，每籠不多于5只，自由飲水，給予顆粒飼料。大鼠顆粒飼料由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品采集

將240只大鼠按體重隨機分成4組：復方甲巰咪唑軟膏高、中、低劑量（分別為25，9，1.5 mg/kg，按甲巰咪唑含量計）組及單方甲巰咪唑軟膏（9 mg/kg）組，每組60只。試驗前于大鼠頸部涂抹10 %硫化鈉脫毛劑，1 d后開始給予不同劑量的復方甲巰咪唑軟膏、5 %甲巰咪唑軟膏。分別于給藥后0.5，1，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0 h，每組取6只動物，頸動脈取血5 ml，3000 r/min離心20 min，取血清，冷凍貯存?zhèn)錅y。同時將大鼠處死后取甲狀腺組織。甲狀腺經(jīng)濾紙吸干后稱重，然后置燒杯中剪碎，加入生理鹽水制備勻漿，冷凍貯存?zhèn)錅y。

2.2 色譜質(zhì)譜條件[6-8]

2.2.1 復方甲巰咪唑軟膏高、中劑量組及單方組大鼠血清測定條件 Agilent高效液相色譜儀；流動相：甲醇-水=10:90（v/v），0.45 μm微孔濾膜過濾，在線脫氣；流速1 ml/min，不分流；色譜柱：XDB-C18柱（5.0 mm×250 mm，4.6 μm），柱溫：35 ℃；進樣量：20 μl；可變波長檢測器（VWD）檢測波長：254 nm。

2.2.2 復方甲巰咪唑軟膏低劑量組大鼠血清及大鼠的甲狀腺組織測定條件 Agilent色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，流動相：乙腈-緩沖液（含0.1 %醋酸和5 mmoL甲酸銨）=15:85（v/v），0.45 μm微孔濾膜過濾，在線脫氣，流速0.3 ml/min，不分流；色譜柱：SB-C18柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫：35 ℃，進樣量：5 μl；檢測器離子源：電噴霧電離（ESI），正離子模式，霧化壓力38 psi，保護氣為氮氣，流速11 L/min；毛細管電壓4000 V，采集方式為多重反應監(jiān)測（MRM）模式；甲巰咪唑母離子m/z=115.0（M+H），碎裂電壓為100 V，子離子為88.0，57.1，碰撞電壓（CE）=20 V，內(nèi)標對乙酰氨基酚母離子m/z=152.1（M+H），碎裂電壓為100 V，子離子為110.1，65.2，CE=20 V。

2.3 樣品處理

2.3.1 復方甲巰咪唑軟膏高、中劑量組及單方組大鼠血清樣品處理 準確吸取待測血清0.5 ml，置入10 ml干凈離心管，加乙腈5 ml，充分振蕩萃取2 min，4000 r/min離心，分離有機相，取有機相3.5 ml，用氮氣吹干溶劑，殘留物用100 μl流動相溶解，進樣10 μl分析，外標法定量。

2.3.2 復方甲巰咪唑軟膏低劑量組大鼠血清樣品處理 準確吸取待測血清0.5 ml，置入10 ml干凈離心管，加內(nèi)標對乙酰氨基酚（1 μg/ml）100 μl，加三氯甲烷5 ml，充分振蕩萃取2 min，4000 r/min離心，分離有機相，取有機相3.5 ml，用氮氣吹干溶劑，殘留物用100 μl流動相溶解，進樣20 μl分析，內(nèi)標法定量。

2.3.3 各組甲狀腺樣品處理 準確吸取待測甲狀腺組織勻漿液0.5 ml置10 ml干凈離心管中，加入內(nèi)標對乙酰氨基酚（1 μg/ml）100 μl，加三氯甲烷5 ml，充分振蕩萃取15 min，離心后分離有機相，取有機相3.5 ml，用氮氣吹干溶劑，殘留物用100 μl流動相溶解，供分析使用。

2.4 對照品儲備液及內(nèi)標溶液的配制

2.4.1 甲巰咪唑儲備液的配制 精密稱取甲巰咪唑10.08 mg，置入100 ml量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成甲巰咪唑濃度為100 μg/ml的儲備液。將儲備液稀釋獲得系列標準溶液。

2.4.2 內(nèi)標溶液的配制 精密稱取對乙酰氨基酚10.02 mg，置入100 ml量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為100 μg/ml的儲備液，將儲備液稀釋獲得濃度為1 μg/ml的內(nèi)標溶液。

2.5 標準曲線及定量下限測定

2.5.1 復方甲巰咪唑軟膏高、中劑量組及單方組線性范圍考察 取空白血清0.5 ml，分別加入甲巰咪唑系列標準溶液10 μl，制備甲巰咪唑濃度為0.1，0.2，0.5，1，2，5，10 μg/ml的樣品，準確吸取0.5 ml，加乙腈5 ml，按2.3.1項下方法處理，以待測物濃度為橫坐標，待測物峰面積為縱坐標，求得線性回歸方程，結(jié)果為：Y=809.38X+386.64，r=0.9936。根據(jù)標準曲線，甲巰咪唑的線性范圍為0.1～10 μg/ml。定量下限為0.1 μg/ml。

2.5.2 復方甲巰咪唑軟膏低劑量組線性范圍考察 取空白血清0.5 ml，分別加入甲巰咪唑標準溶液10 μl，制備甲巰咪唑濃度為5，10，20，50，100，200 ng/ml的樣品，準確吸取0.5 ml，按2.3.2項下方法操作，以待測物濃度為橫坐標，待測物與內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標，求得線性回歸方程，結(jié)果為：Y=1.2597X-0.0409，r=0.9920。根據(jù)標準曲線，甲巰咪唑的線性范圍為5～200 ng/ml。定量下限為5 ng/ml。

2.5.3 各組甲狀腺組織線性范圍考察 取空白甲狀腺組織勻漿液，分別加入甲巰咪唑標準溶液10 μl，制備甲巰咪唑濃度為5，10，50，100，200，500，1000 ng/mg的樣品，準確吸取0.5 ml，按2.3.3項下方法操作，以待測物濃度為橫坐標，待測物與內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標，求得線性回歸方程，結(jié)果為：Y=0.8011X-0.2343，r=0.9944。根據(jù)標準曲線，甲巰咪唑的線性范圍為5～1000 ng/mg。定量下限為5 ng/mg。

2.6 精密度考察

2.6.1 復方甲巰咪唑軟膏高、中劑量組及單方組精密度考察 取空白血清0.5 ml，分別加入甲巰咪唑標準溶液10 μl，制備低、中、高3個濃度（0.1，2，10 μg/ml）的樣品，準確吸取0.5 ml，按2.3.1項下方法操作，每一濃度進行5樣本分析，連續(xù)配制分析3 d，以標準曲線計算甲巰咪唑的濃度，統(tǒng)計批內(nèi)精密度RSD＜11.22 %，批間精密度RSD＜10.30%，準確度（RE）范圍為87.56 %～111.16 %。

2.6.2 復方甲巰咪唑軟膏低劑量組精密度考察 取空白血清0.5 ml，分別加入甲巰咪唑標準溶液10 μl，制備低、中、高3個濃度（5，50，200 ng/ml）的樣品，準確吸取0.5 ml，按2.3.2項下方法操作，每一濃度進行5樣本分析，并連續(xù)配制分析3 d，以標準曲線計算甲巰咪唑的濃度，批內(nèi)精密度RSD＜8.90 %，批間精密度RSD＜6.79 %，準確度（RE）范圍為91.00 %～103.83 %。

2.6.3 各組甲狀腺組織精密度考察 取空白甲狀腺組織勻漿液，分別加入甲巰咪唑標準溶液10 μl，配制低、中、高3個濃度（5，200，1000 ng/mg）的樣品，準確吸取0.5 ml，按2.3.3項下依法操作，每一濃度進行5樣本分析，連續(xù)配制分析3 d，以標準曲線計算甲巰咪唑的濃度，批內(nèi)精密度RSD＜12.67 %，批間精密度RSD＜10.23 %，準確度（RE）范圍為88.33 %～111.73 %。

2.7 回收率考察

2.7.1 復方甲巰咪唑軟膏高、中劑量組及單方組回收率考察 取空白血清0.5 ml，分別加入甲巰咪唑標準溶液10 μl，制備低、中、高3個濃度（0.1，2，10 μg/ml）的樣品，準確吸取0.5 ml，按2.3.1項方法操作，每一濃度進行5樣本分析，處理后進樣檢測；另取空白血清同法處理，向獲得的上清加入相應濃度的標準溶液。以每一濃度兩種處理方法峰面積比值計算回收率，計算相對回收率為86.80 %～89.58 %。

2.7.2 復方甲巰咪唑軟膏低劑量組回收率考察 取空白血清0.5 ml，分別加入甲巰咪唑標準溶液10 μl，制備低、中、高3個濃度（5，50，200 ng/ml）的樣品，準確吸取0.5 ml，按2.3.2項下方法操作，每一濃度進行5樣本分析，處理后進樣檢測；另取空白血清同法處理，向獲得的上清液加入相應濃度的內(nèi)標和標準溶液。以每一濃度兩種處理方法峰面積比值計算回收率，計算相對回收率為91.00 %～101.21 %。

2.7.3 各組甲狀腺組織回收率考察 取空白甲狀腺組織勻漿液，分別加入甲巰咪唑標準溶液10 μl，配制低、中、高3個濃度（5，200，1000 ng/mg）的樣品，準確吸取0.5 ml，按2.3.3項下方法操作，每一濃度進行5樣本分析，處理后進樣檢測；另取空白勻漿液同法處理，向獲得的上清液加入相應濃度的內(nèi)標和標準溶液。以每一濃度兩種處理方法峰面積比值計算回收率，計算相對回收率為88.33 %～108.97 %。

2.8 穩(wěn)定性考察

2.8.1 預處理后室溫放置24 h穩(wěn)定性考察

2.8.1.1 復方甲巰咪唑軟膏高、中劑量組及單方組穩(wěn)定性考察 將進樣器內(nèi)批內(nèi)精密度樣本常溫放置24 h，再次進樣，按標準曲線計算甲巰咪唑濃度，結(jié)果準確度（RE）范圍為93.84 %～112.60 %。

2.8.1.2 復方甲巰咪唑軟膏低劑量組穩(wěn)定性考察 將進樣器內(nèi)批內(nèi)精密度樣本常溫放置24 h，再次進樣，按標準曲線計算甲巰咪唑濃度，結(jié)果準確度（RE）范圍為94.85 %～97.63 %。

2.8.1.3 各組甲狀腺組織穩(wěn)定性考察 將進樣器內(nèi)批內(nèi)精密度樣本常溫放置24 h，再次進樣，按標準曲線計算甲巰咪唑濃度，結(jié)果準確度（RE）范圍為104.38 % ～108.34 %。

2.8.2 -20 ℃放置100 d凍融穩(wěn)定性考察

2.8.2.1 復方甲巰咪唑軟膏高、中劑量組及單方組穩(wěn)定性考察 取空白血清0.5 ml，分別加入甲巰咪唑標準溶液10 μl，制備低、中、高3個濃度（0.1，2，10 μg/ml）的樣品，-20 ℃放置100 d，解凍后，準確吸取0.5 ml，按2.3.1項下方法操作，按標準曲線計算甲巰咪唑濃度，結(jié)果準確度（RE）范圍為91.33 %～116.33 %。

2.8.2.2 復方甲巰咪唑軟膏低劑量組穩(wěn)定性考察 取空白血清0.5 ml，分別加入甲巰咪唑標準溶液10 μl，制備低、中、高3個濃度（5，50，200 ng/ml）的樣品，-20 ℃放置100 d，解凍后，準確吸取0.5 ml，按2.3.2項下方法操作，按標準曲線計算甲巰咪唑濃度，結(jié)果準確度（RE）范圍為102.33 %～105.47 %。

2.8.2.3 各組甲狀腺組織穩(wěn)定性考察 取空白甲狀腺組織勻漿液，分別加入甲巰咪唑標準溶液10 μl，配制低、中、高3個濃度（5，200，1000 ng/mg）的樣品，-20 ℃放置100 d，解凍后，準確吸取0.5 ml，按2.3.3項下方法操作，按標準曲線計算甲巰咪唑濃度，結(jié)果準確度（RE）范圍為96.36 %～100.43 %。

2.9 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)所測甲巰咪唑血清、甲狀腺藥物濃度-時間數(shù)據(jù)，采用DAS2.1.1軟件計算以下藥動學參數(shù)：t1/2、Vd、CL、AUC0-t、AUC0-∞、Cmax、Tmax等，除Cmax和Tmax為實測值外，其余參數(shù)均為統(tǒng)計矩參數(shù)。利用SPSS16.0對各組的藥動學參數(shù)進行單因素方差分析，P值小于0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2.10 大鼠血清及甲狀腺組織藥物濃度-時間數(shù)據(jù)

大鼠涂抹不同劑量的復方甲巰咪唑軟膏及單方甲巰咪唑軟膏，經(jīng)HPLC或LC-MS/MS分析后，不同劑量組及單方組的血清/甲狀腺藥物濃度-時間數(shù)據(jù)見圖1～圖3。

圖1 復方甲巰咪唑軟膏高、中劑量組、單方甲巰咪唑軟膏組（9 mg/kg）大鼠血清甲巰咪唑藥時曲線

圖2 復方甲巰咪唑軟膏低劑量組（1.5 mg/kg）大鼠血清甲巰咪唑藥時曲線

圖3 復方甲巰咪唑軟膏高、中、低劑量組及單方甲巰咪唑軟膏組（9 mg/kg）大鼠甲狀腺組織中甲巰咪唑藥時曲線

2.11 主要藥動學參數(shù)及統(tǒng)計

大鼠單次頸部涂抹復方甲巰咪唑軟膏高、中、低劑量及單方甲巰咪唑軟膏后甲巰咪唑在血清中的主要藥動學參數(shù)見表1，在甲狀腺組織中的主要藥動學參數(shù)見表2。

甲巰咪唑在大鼠體內(nèi)吸收迅速，血清濃度達峰時間約為2.0 h，甲狀腺濃度達峰時間約為1.3 h，血清消除半衰期約為2.4 h，甲狀腺消除半衰期約為4.6 h。由統(tǒng)計學結(jié)果可知，復方甲巰咪唑軟膏的高、中、低劑量之間，血清及甲狀腺組織中，除AUC、Cmax外其余參數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義，相同劑量下，復方給藥與單方給藥相比，血清中甲巰咪唑的Tmax存在差異，其余參數(shù)差異并無統(tǒng)計學意義。與單方組比較，復方中劑量組給藥后甲巰咪唑在血清中的相對生物利用度為58.52 %，在甲狀腺組織中的相對生物利用度為80.62 %。

3 討論

與HPLC相較，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)靈敏、快速、高效，更適用于藥物代謝研究，但本試驗中由于部分樣本濃度偏高，需采用空白基質(zhì)稀釋后測定，稀釋10倍以上即存在稀釋效應致使準確度偏離，因此本研究針對不同濃度水平的生物樣本分別采用HPLC及LC-MS/MS進行測試，建立了兩種分析方法并分別進行驗證，保證樣本檢測的準確性。

針對甲狀腺組織的前處理，由于單只大鼠甲狀腺體積小不易勻漿，而甲巰咪唑易溶于三氯甲烷，本試驗中稱量甲狀腺組織直接加入三氯甲烷振蕩萃取，并相應延長萃取時間，方法學驗證表明此種固液萃取方法甲巰咪唑提取回收率可滿足分析需求。

表1 大鼠頸部涂抹復方甲巰咪唑軟膏高、中、低劑量及單方甲巰咪唑軟膏后甲巰咪唑在血清中的主要藥動學參數(shù)（n=6, ）

表1 大鼠頸部涂抹復方甲巰咪唑軟膏高、中、低劑量及單方甲巰咪唑軟膏后甲巰咪唑在血清中的主要藥動學參數(shù)（n=6, ）

注：*P＜0.05 vs 復方甲巰咪唑軟膏中劑量組，**P＜0.01 vs 復方甲巰咪唑軟膏中劑量組

單方甲巰咪唑軟膏組AUC0-12 h/mg·(L·h)-1 38.24±7.12** 10.37±3.10 0.25±0.07** 15.32±4.96藥動學參數(shù)復方甲巰咪唑軟膏高劑量組復方甲巰咪唑軟膏中劑量組復方甲巰咪唑軟膏低劑量組AUC0-∞/mg·(L·h)-1 61.95±23.33** 11.13±3.51 0.33±0.21** 19.02±3.94 t1/2/h 2.73±1.28 1.64±1.02 2.25±1.54 3.06±1.29 Tmax/h 2.25±1.17 1.33±1.44* 1.75±0.69 2.83±1.13 Vd/L·kg-1 3.19±0.69 1.84±0.97 2.70±1.77 2.28±1.41 CL/L·(h·kg)-1 0.46±0.18 0.89±0.31 0.76±0.26 0.49±0.11 Cmax/mg·L-1 9.50±1.43** 2.88±0.43 0.07±0.01** 3.78±0.36

表2 大鼠頸部涂抹復方甲巰咪唑軟膏高、中、低劑量及單方甲巰咪唑軟膏后甲巰咪唑在甲狀腺中的主要藥動學參數(shù)（n=6, ）

表2 大鼠頸部涂抹復方甲巰咪唑軟膏高、中、低劑量及單方甲巰咪唑軟膏后甲巰咪唑在甲狀腺中的主要藥動學參數(shù)（n=6, ）

注：**P＜0.01 vs 復方甲巰咪唑軟膏中劑量組

單方甲巰咪唑軟膏組AUC0-12h /ng·(mg·h)-1 221.91±42.74** 117.17±25.22 75.23±12.75** 139.28±35.31 AUC0-∞ /ng·(mg·h)-1 288.65±57.01** 145.08±35.48 109.83±21.14** 179.96±48.83 t1/2/h 3.89±1.19 4.13±2.02 5.25±3.54 5.10±2.97 Tmax/h 1.50±0.32 1.00 1.25±0.61 1.50±0.63 Vd/mg·kg-1 465.67±189.67 346.93±190.12 317.63±116.33 325.95±191.71 CL/mg·(h·kg)-1 49.73±19.08 55.32±16.70 54.23±25.73 45.74±15.09 Cmax/ng·mg-1 63.29±9.60** 32.34±10.20 20.71±6.09** 42.33±10.71藥動學參數(shù) 復方甲巰咪唑軟膏高劑量組復方甲巰咪唑軟膏中劑量組復方甲巰咪唑軟膏低劑量組

大鼠頸部皮膚給予高、中、低劑量復方甲巰咪唑軟膏后，血清及甲狀腺組織中甲巰咪唑濃度呈現(xiàn)劑量依賴性，其AUC與劑量呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，提示甲巰咪唑在大鼠體內(nèi)呈現(xiàn)線性動力學特征，與文獻報道相符[6]。相同劑量下，復方甲巰咪唑軟膏與單方制劑相比，靶部位及血清藥物暴露水平接近，除達峰時間更早外其余藥動學參數(shù)無差異，說明復方制劑中氫化可的松對甲巰咪唑的藥代動力學特征影響小，兩者可配伍協(xié)同發(fā)揮藥效。