劉超，王鑫，景贊，呂雪梅，黃志勇，馮慧

(1.樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂山 614000；2.黑龍江東方學(xué)院 學(xué)務(wù)處，哈爾濱 150066)

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

秋葵籽粕：市售，存于冰箱里冷凍；麩皮：四川嘉糧企業(yè)(集團(tuán))樂山面粉廠；面粉：市售；As3.042、UE336、UE336-2、As3.811：上海釀造研究所；米曲霉秋田種曲：株式會(huì)社秋田今野商店；甲醛(分析純)，磷酸二氫鈉(分析純)、磷酸氫二鈉(分析純)：成都科龍化工試劑廠；干酪素：北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 主要設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 寧波天恒儀器廠；MJP-150型霉菌培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FA124型電子天平 上海市舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DUG-9076A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 測(cè)定方法

中性蛋白酶酶活力的測(cè)定：采用蛋白酶活力測(cè)定法；水分的測(cè)定：采用食品中水分的測(cè)定方法[9]。

1.4 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按蛋白酶活力測(cè)定法中1.3.1.2的要求，配制不同濃度的酪蛋白濃度。以凈OD值為橫坐標(biāo)，酪氨酸質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同濃度的酪氨酸溶液見表1。

1.5 菌種的篩選

本試驗(yàn)以中性蛋白酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，于5個(gè)350 mL組培瓶中加入粉碎的烘至水分含量為10%左右的秋葵籽粕30 g，添加乳糖量為8%，加蒸餾水至曲水分含量為45%左右(±3%)，pH 6～7(自然)，滅菌后分別接入米曲霉As3.042、寧佐美曲霉、UE336-2米曲霉、米曲霉As3.811、米曲霉秋田種曲各6%，4層紗布潤(rùn)濕覆蓋，霉菌培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)60 h后測(cè)定中性蛋白酶活力。最終篩選出米曲霉As3.042為最優(yōu)菌種。

1.6 制曲條件的優(yōu)化

制曲是我國(guó)釀造工業(yè)的一項(xiàng)傳統(tǒng)技術(shù)，是醬油釀造的重要環(huán)節(jié)。制曲時(shí)，從米曲霉菌體中分泌出的酶，不但使原料發(fā)生了變化，也是以后發(fā)酵期間發(fā)生變化的根源。所以，制曲的好壞直接影響醬品質(zhì)和原料利用率。

“問渠哪得清如許？為有源頭活水來?！比A北分公司總經(jīng)理呂新華對(duì)研究部署工作高度重視。井位部署是上游企業(yè)一切工作的開始， 井位部署質(zhì)量的高低承載著眾人的期望和關(guān)注。研究院承擔(dān)著井位部署和其他科研工作，重要性不喻而言。

1.6.1 碳源種類對(duì)制曲的影響

于5個(gè)350 mL組培瓶中加入粉碎的烘至水分含量為10%左右的秋葵籽粕30 g，分別添加6%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、糊精。加蒸餾水至曲水分含量為45%左右(±3%)，pH 6～7(自然)，滅菌后接入米曲霉As3.042種曲6%，4層紗布潤(rùn)濕覆蓋，霉菌培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)60 h后測(cè)定中性蛋白酶活力，確定最佳的碳源種類。

1.6.2 碳源添加量對(duì)制曲的影響

于6個(gè)350 mL組培瓶中加入粉碎的烘至水分含量為10%左右的秋葵籽粕30 g，分別加入碳源由(1.6.1確定)0、1%、3%、5%、7%、9%。加蒸餾水至曲水分含量為45%左右(±3%)，pH 6～7(自然)，滅菌后接入米曲霉As3.042種曲6%，4層紗布潤(rùn)濕覆蓋，霉菌培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)60 h后測(cè)定中性蛋白酶活力，得到最優(yōu)的碳源添加量。

1.6.3 菌種接種量對(duì)制曲的影響

于6個(gè)350 mL組培瓶中加入粉碎的烘至且水分含量為10%左右的秋葵籽粕30 g，加碳源(由1.6.1、1.6.2確定)及蒸餾水至曲水分含量為45%左右(±3%)。分別按1%、3%、5%、7%、9%、11%的接種量接入米曲霉As3.042種曲，4層紗布潤(rùn)濕覆蓋，霉菌培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)60 h，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定中性蛋白酶活力，得到最優(yōu)的菌種接種量。

1.6.4 曲水分含量對(duì)制曲的影響

于6個(gè)350 mL組培瓶中加入粉碎的烘至水分含量為10%左右的秋葵籽粕30 g，加碳源(由1.6.1、1.6.2確定)，曲水分含量分別控制在35%、45%、55%、65%、75%、85%，pH 6～7(自然)。滅菌后按1.6.3確定的米曲霉As3.042接種量，4層紗布潤(rùn)濕覆蓋，霉菌培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)60 h后測(cè)定中性蛋白酶活力，得到最佳的曲含水量。

1.6.5 培養(yǎng)溫度對(duì)制曲的影響

于4個(gè)350 mL組培瓶中加入粉碎的烘至水分含量為10%左右的秋葵籽粕30 g，加碳源(由1.6.1、1.6.2確定)及蒸餾水至1.6.4確定的曲水分含量，pH 6～7(自然)。滅菌后接入1.6.3確定的米曲霉As3.042接種量，4層紗布潤(rùn)濕覆蓋，于24，27，30，33 ℃溫度下分別培養(yǎng)60 h后測(cè)定中性蛋白酶活力，得到最優(yōu)的培養(yǎng)溫度。

1.6.6 制曲時(shí)間對(duì)制曲的影響

于7個(gè)350 mL組培瓶中加入粉碎的烘至水分含量為10%左右的秋葵籽粕30 g，加碳源(由1.6.1、1.6.2確定)及蒸餾水至1.6.4確定的曲含水量，按1.6.5確定的溫度于霉菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，pH 6～7(自然)。滅菌后接入1.6.3確定的米曲霉As3.042量，4層紗布潤(rùn)濕覆蓋，培養(yǎng)時(shí)間分別為24，36，48，60，72，84，96 h。結(jié)束后分別測(cè)定中性蛋白酶活力，得到最佳的培養(yǎng)時(shí)間。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

以凈OD值為橫坐標(biāo)，酪氨酸質(zhì)量為縱坐標(biāo)，得到酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源種類對(duì)制曲的影響

由圖2可知，添加不同碳源對(duì)種曲的中性蛋白酶活力有不同的影響。以乳糖作為碳源，中性蛋白酶活最高，葡萄糖、蔗糖次之，麥芽糖、可溶性淀粉最差。這可能是米曲霉As3.042對(duì)乳糖的利用率最高，即本試驗(yàn)選取的最佳碳源為乳糖。

圖2 不同碳源對(duì)制曲的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on koji making

2.2.2 乳糖添加量對(duì)制曲的影響

圖3 乳糖添加量對(duì)制曲的影響Fig.3 Effect of the additive amount of lactose on koji making

由圖3可知，乳糖添加量為7%時(shí)，中性蛋白酶活力達(dá)到最高。當(dāng)乳糖添加量在0～7%范圍內(nèi)，中性蛋白酶活力隨著乳糖添加量的增加而增大，這說明在一定范圍內(nèi)，碳源越多，米曲霉As3.042產(chǎn)中性蛋白酶越多；當(dāng)乳糖含量過高時(shí)，中性蛋白酶活力下降，這可能是碳源過高對(duì)米曲霉的生長(zhǎng)起抑制作用，所以本試驗(yàn)選擇乳糖添加量為7%。

2.2.3 接種量對(duì)制曲的影響

圖4 接種量對(duì)制曲的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on koji making

由圖4可知，在一定的范圍內(nèi)，中性蛋白酶活力隨著接種量的增加而升高。當(dāng)接菌量過低時(shí)，無法在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)中性蛋白酶相對(duì)較少，酶活較低。當(dāng)接種量為7%時(shí)，中性蛋白酶活力達(dá)到較大值；當(dāng)接種量為11%時(shí)，中性蛋白酶活力反而下降，這可能是因?yàn)榻泳繛?1%時(shí)由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給不足，米曲霉As3.042產(chǎn)生大量的休眠孢子，不能產(chǎn)生有效的中性蛋白酶。所以，本試驗(yàn)確定接種量為7%。

2.2.4 曲水分含量對(duì)制曲的影響

圖5 曲水分含量對(duì)制曲的影響Fig.5 Effect of the moisture content of koji on koji making

由圖5可知，當(dāng)曲水分含量為60%時(shí)，中性蛋白酶活力達(dá)到最大值，說明曲水分含量為60%時(shí)米曲霉As3.042達(dá)到最佳的生長(zhǎng)及產(chǎn)中性蛋白酶的狀況，即本試驗(yàn)選擇60%的曲水分含量。

2.2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)制曲的影響

圖6 不同制曲溫度對(duì)制曲的影響Fig.6 Effect of different koji-making temperatureson koji making

由圖6可知，在一定的溫度范圍內(nèi)，中性蛋白酶活力隨著制曲溫度的升高而升高，在30 ℃時(shí)中性蛋白酶活力達(dá)到最高。此時(shí)品溫達(dá)到33 ℃，米曲霉分泌蛋白酶最旺盛。當(dāng)溫度在33 ℃時(shí)，此時(shí)品溫達(dá)到36 ℃，此溫度不適合米曲霉的繁殖生長(zhǎng)，即本試驗(yàn)選擇最佳的制曲溫度為30 ℃。

2.2.6 制曲時(shí)間對(duì)制曲的影響

由圖7可知，在24～96 h范圍內(nèi)，中性蛋白酶活力隨著制曲時(shí)間的增加而升高，在制曲時(shí)間在36～48 h過程中，中性蛋白酶活力出現(xiàn)了質(zhì)的飛躍，可能是在此階段米曲霉As3.042孢子逐漸成熟，蛋白酶的分泌最為旺盛。在制曲時(shí)間為60 h時(shí)，中性蛋白酶活力達(dá)到較高值?？紤]到生產(chǎn)效率，本試驗(yàn)制曲時(shí)間選擇60 h。

圖7 不同制曲時(shí)間對(duì)制曲的影響Fig.7 Effect of different koji making time on koji making

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以秋葵籽粕為原料，以米曲霉As3.042為菌種，米曲霉As3.042產(chǎn)中性蛋白酶活力受碳源種類、碳源添加量、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、曲水分含量等影響。本試驗(yàn)制曲最適條件為乳糖添加量6%、接種量8%、培養(yǎng)溫度31 ℃、曲水分含量60%、制曲時(shí)間60 h，此條件下成曲中性蛋白酶活力為6729.8 U/g。