琚書光，段旭華，韓新巍，任建莊，李 浩，李鳳堯，王滿周

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射介入科，河南 鄭州 450052)

經(jīng)導(dǎo)管治療包括經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞術(shù)(transcatheter arterial embolization， TAE)和TACE，已廣泛用于治療無(wú)法切除的肝癌[1-2]。射頻消融(radiofrequency ablation， RFA)可以根治早期肝癌[3]。TACE或TAE聯(lián)合RFA能增加消融范圍，提高RFA效果[4-5]。本研究對(duì)比分析TACE或TAE聯(lián)合RFA對(duì)兔VX2肝腫瘤的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備 日本大耳白兔63只，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，許可證編號(hào)：SYXK(豫)2016-0002。VX2腫瘤株移植制備：采用Virmani等[6]的方法，將VX2腫瘤塊(由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng))移植入兔肝左內(nèi)側(cè)葉，移植15天后MRI觀察VX2腫瘤是否形成及其大小[7]，測(cè)量各組瘤體最大層面的最大長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將60只成功建立VX2肝腫瘤模型(圖1A)的實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為4組，每組15只。對(duì)TACE+RFA組以0.4 mg阿霉素+0.4 ml碘油進(jìn)行TACE治療15 min后行RFA；TAE+RFA組采用150～250 μm聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)顆粒行TAE治療15 min后行RFA；RFA組僅給予RFA；TACE組僅給予TACE(圖1B、1C)。TACE、TAE均在Siemens Artis Q Zeego DSA機(jī)引導(dǎo)下進(jìn)行，RFA操作過(guò)程參照文獻(xiàn)[7]。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 肝功能 分別在術(shù)前1天及術(shù)后3、7天自兔耳緣靜脈采集血液標(biāo)本，離心后取血清，采用標(biāo)準(zhǔn)酶法測(cè)定血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase， ALT)水平。

1.3.2 腫瘤生長(zhǎng)率、腫瘤壞死率及Suzuki評(píng)分 于術(shù)后1、3、7天各組分別處死5只兔。TACE+RFA組、TAE+RFA組、RFA組均沿射頻消融針主針道切開(kāi)消融肝組織，每隔3～5 mm分片，測(cè)量瘤體最大長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)；TACE組沿長(zhǎng)軸切開(kāi)腫瘤，于最大切面測(cè)量最大長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)。分別測(cè)量各組瘤體切面壞死區(qū)長(zhǎng)徑(c)和短徑(d)。

參照文獻(xiàn)[8]方法計(jì)算術(shù)后7天腫瘤生長(zhǎng)率、腫瘤壞死率：腫瘤生長(zhǎng)率=腫瘤體積術(shù)后/腫瘤體積術(shù)前×100%，腫瘤體積=1/2ab2，腫瘤壞死率=cd/ab×100%。將腫瘤組織置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后4 μm厚切片，常規(guī)HE染色后行Suzuki評(píng)分[9]，評(píng)價(jià)壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝組織損傷程度。

1.3.3 熱休克蛋白70(heat shock protein 70， HSP70)表達(dá) 參照文獻(xiàn)[10]方法對(duì)壞死區(qū)或凝固區(qū)肝組織行HSP70免疫組織化學(xué)染色。由2名高年資病理科醫(yī)師在200倍鏡下以盲法進(jìn)行評(píng)價(jià)，TACE組在肝臟壞死區(qū)周圍組織取圖，RFA組、TAE+RFA組和TACE+RFA組在肝臟凝固壞死區(qū)周圍組織取圖。Image-Pro Plus Software(version 6.0)軟件分析圖像，自動(dòng)計(jì)算HSP70累計(jì)光密度(integrated optical density， IOD)。

1.3.4 凋亡指數(shù) 采用TUNEL法檢測(cè)壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細(xì)胞凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)為每張切片中每100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。在200倍鏡下計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均值，每個(gè)樣本評(píng)估5個(gè)視野，取平均數(shù)作為結(jié)果。

1.3.5 增殖指數(shù) 采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝組織Ki-67表達(dá)，計(jì)數(shù)每張切片中6個(gè)200倍視野內(nèi)Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算增殖指數(shù)。增殖指數(shù)為每個(gè)視野中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占肝細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較各組間、同組不同時(shí)間點(diǎn)間各指標(biāo)差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

成功建立60只兔VX2肝腫瘤模型，腫瘤最大徑11.52～16.91 mm，平均(12.78±3.53)mm。

2.1 血清ALT、AST 4組兔術(shù)前1天血清ALT和AST水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。術(shù)后3、7天TACE+RFA組ALT、AST水平均高于其他3組，術(shù)后3天TACE+RFA組、TAE+RFA組、TACE組均高于術(shù)前1天及術(shù)后7天，術(shù)后3、7天TACE組均高于TAE+RFA組、RFA組，術(shù)后3天TAE+RFA組均高于RFA組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 腫瘤生長(zhǎng)率、腫瘤壞死率及Suzuki評(píng)分 術(shù)后7天TACE+RFA組Suzuki評(píng)分高于其他3組，TACE+RFA組、TAE+RFA組腫瘤生長(zhǎng)率均低于RFA組和TACE組(P均<0.05)，腫瘤壞死率均高于RFA組和TACE組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 HSP70表達(dá) 術(shù)后1、3、7天4組壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝組織HSP70表達(dá)均逐漸升高(P均<0.01)。術(shù)后1、3、7天TACE+RFA組HSP70表達(dá)均高于其他3組(P均<0.01)；術(shù)后1、3天TAE+RFA組HSP70表達(dá)均高于TACE組和RFA組(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 凋亡指數(shù) 術(shù)后1、3、7天4組壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細(xì)胞凋亡指數(shù)均逐漸降低(P均<0.01)。術(shù)后1、3、7天TACE+RFA組凋亡指數(shù)均高于其他3組(P均<0.01)，術(shù)后1、3天TACE組均高于TAE+RFA組、RFA組(P均<0.05)。見(jiàn)表4、圖2。

2.5 增殖指數(shù) 術(shù)后3天4組肝細(xì)胞增殖指數(shù)均高于術(shù)后1、7天(P均<0.05)。術(shù)后1、3、7天TAE+RFA組增殖指數(shù)均高于其他3組(P均<0.05)，術(shù)后1、3天RFA組均高于TACE+RFA組和TACE組(P均<0.05)。見(jiàn)表5、圖3。

圖1 TACE組影像學(xué)表現(xiàn) A.植入腫瘤15天后，MR T1WI示兔肝左葉見(jiàn)直徑約16 mm低信號(hào)區(qū)； B.TACE術(shù)中肝動(dòng)脈造影示肝左葉富血供占位性病變； C.以碘油乳化液栓塞病變

表1 各組兔不同時(shí)間點(diǎn)血清ALT、AST水平比較(U/L，±s)

表1 各組兔不同時(shí)間點(diǎn)血清ALT、AST水平比較(U/L，±s)

組別ALT術(shù)前1天術(shù)后3天術(shù)后7天F值P值TACE+RFA組35.31±8.60178.67±31.43123.09±10.6366.853<0.001TAE+RFA組33.19±9.3984.21±28.1057.30±22.217.1220.009TACE組33.08±9.41136.11±25.4286.71±23.1431.414<0.001RFA組36.20±10.6149.30±12.5456.70±18.812.5990.115F值0.13225.18113.205——P值0.940<0.001<0.001——組別AST術(shù)前1天術(shù)后3天術(shù)后7天F值P值TACE+RFA組48.11±12.21263.78±14.41160.30±15.22297.272<0.001TAE+RFA組46.81±13.89125.11±27.5381.21±25.4914.2220.001TACE組46.78±13.90159.29±32.08116.21±19.3030.277<0.001RFA組49.29±10.5060.21±18.8166.44±22.211.1750.342F值0.04561.63619.984——P值0.987<0.001<0.001——

表2 各組兔術(shù)后7天腫瘤生長(zhǎng)率、壞死率及Suzuki評(píng)分比較(±s)

表2 各組兔術(shù)后7天腫瘤生長(zhǎng)率、壞死率及Suzuki評(píng)分比較(±s)

組別腫瘤生長(zhǎng)率(%)腫瘤壞死率(%)Suzuki評(píng)分TACE+RFA組116.48±36.4191.49±14.284.26±2.29TAE+RFA組122.89±52.3487.50±20.811.89±1.24TACE組334.38±53.1058.47±13.722.16±1.31RFA組242.11±48.3266.45±14.901.13±1.01F值21.3813.9953.478P值<0.0010.0470.041

表3 各組兔術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝組織HSP70表達(dá)的IOD值比較(±s)

表3 各組兔術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝組織HSP70表達(dá)的IOD值比較(±s)

組別術(shù)后1天術(shù)后3天術(shù)后7天F值P值TACE+RFA組2 618.12±153.4915 981.20±3 108.2229 750.20±4 121.53103.510<0.001TAE+RFA組2 142.32±330.6112 210.20±3 462.9021 158.29±4 412.2543.004<0.001TACE組1 247.54±191.488 158.15±1 996.7114 526.20±4 468.1527.580<0.001RFA組976.32±341.167 283.90±2 875.2012 304.50±5 673.3211.9130.001F值41.0039.46413.868——P值<0.0010.001<0.001——

表4 各組兔不同時(shí)間點(diǎn)壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(個(gè)，±s)

表4 各組兔不同時(shí)間點(diǎn)壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(個(gè)，±s)

組別術(shù)后1天術(shù)后3天術(shù)后7天F值P值TACE+RFA組25.67±2.1116.45±3.4211.29±3.8825.512<0.001TAE+RFA組10.32±3.899.80±2.403.32±1.909.3120.004TACE組17.20±1.3112.10±1.565.81±2.2154.049<0.001RFA組7.53±3.196.92±2.511.51±0.589.7960.003F值41.74312.57515.145——P值<0.001<0.001<0.001——

3 討論

Li等[11]發(fā)現(xiàn)TACE治療過(guò)程中適當(dāng)減少化學(xué)治療藥物劑量和次數(shù)對(duì)近期療效無(wú)影響，且可保護(hù)肝功能，有益于長(zhǎng)期預(yù)后。尹建等[12]認(rèn)為TACE+RFA治療肝癌近中期療效優(yōu)于單純RFA治療，遠(yuǎn)期療效無(wú)明顯差異。Bonomo等[13]采用TAE+RFA治療不能切除的直徑16～59 mm肝癌，獲得與TACE+RFA相近療效。

表5 各組兔不同時(shí)間點(diǎn)壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細(xì)胞增殖指數(shù)比較(%，±s)

表5 各組兔不同時(shí)間點(diǎn)壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細(xì)胞增殖指數(shù)比較(%，±s)

組別術(shù)后1天術(shù)后3天術(shù)后7天F值P值TACE+RFA組6.67±2.1011.53±3.408.33±3.523.8730.044TAE+RFA組15.30±3.9124.81±2.4212.31±1.8925.856<0.001TACE組5.21±1.328.11±1.586.78±2.214.1580.037RFA組9.53±3.1914.89±2.518.50±2.617.5810.007F值12.58339.7473.998——P值<0.001<0.0010.027——

圖2 術(shù)后1天肝臟壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍見(jiàn)典型TUNEL染色(箭示陽(yáng)性細(xì)胞，×200) A～D.分別為TACE組、RFA組、TACE+RFA組及TAE+RFA組

圖3 術(shù)后3天肝臟壞死或凝固區(qū)周圍見(jiàn)Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞(箭，×200) A～D.分別為TACE組、RFA組、TACE+RFA組及TAE+RFA組

經(jīng)導(dǎo)管治療聯(lián)合RFA治療不可切除肝癌臨床療效確切，但肝功能損傷情況罕見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)肝腫瘤兔模型分別給予TACE+RFA、TAE+RFA、TACE、RFA治療，通過(guò)腫瘤生長(zhǎng)率和壞死率觀察腫瘤控制情況，以ALT、AST分析肝功能變化，檢測(cè)消融壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細(xì)胞HSP70表達(dá)和細(xì)胞增殖觀察肝細(xì)胞恢復(fù)能力，以肝細(xì)胞凋亡判斷肝組織損傷程度，發(fā)現(xiàn)TACE+RFA較TAE+RFA、RFA或TACE更能有效地破壞腫瘤，而控制腫瘤效果與TAE+RFA無(wú)顯著差異，與前期研究[7]結(jié)果相符；但TACE+RFA治療所致肝功能損傷最為嚴(yán)重，而TAE+RFA治療肝功能損傷相對(duì)較輕，可能與后者不存在化學(xué)藥物所致細(xì)胞毒性作用有關(guān)[7,14]。

高溫、化學(xué)藥物和缺氧等均可誘導(dǎo)細(xì)胞高表達(dá)HSP70[15]。RFA動(dòng)物肝臟后，HSP70是肝組織消融區(qū)周圍肝細(xì)胞內(nèi)最主要的熱休克蛋白[16]，具有保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、促進(jìn)細(xì)胞存活、促進(jìn)受損細(xì)胞恢復(fù)、抑制消融區(qū)外周細(xì)胞凋亡和壞死等作用[15]。本研究中，術(shù)后1、3、7天TACE+RFA組肝組織HSP70表達(dá)和肝細(xì)胞凋亡均最多，提示TACE聯(lián)合RFA治療中消融區(qū)周圍肝細(xì)胞受到的熱損傷、缺氧及細(xì)胞毒性損傷最大，更多肝細(xì)胞需要從可逆細(xì)胞損傷狀態(tài)中恢復(fù)；術(shù)后7天TAE+RFA組、TACE組和RFA組HSP70表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示上述3種治療方式下肝細(xì)胞更易修復(fù)。4組實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后3天壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細(xì)胞增殖指數(shù)均高于術(shù)后1天，術(shù)后7天始逐漸回落，提示術(shù)后7天內(nèi)肝臟功能趨于恢復(fù)正常。TAE+RFA組術(shù)后1、3、7天增殖指數(shù)均高于TACE+RFA組及TACE組，提示其肝功能損傷更小，可能是治療肝癌更有益的方法。但本研究?jī)H觀察至術(shù)后7天，尚待進(jìn)一步研究。