楊 旭，翁雅芳，羅模桂，汪 瑜，劉官智△

1.四川省自貢市第四人民醫(yī)院(自貢643000)；2.四川省衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院(自貢643000)；3.成都市癌癥防治中心(成都市腫瘤質(zhì)控中心)(成都 610041)

急性濕疹(Atopic eczema，AE)是最常見的皮膚病，每5個(gè)人中就有一個(gè)在一生中受到影響，最近的數(shù)據(jù)顯示，其患病率仍在上升，特別是在低收入國(guó)家。其發(fā)病是一種復(fù)雜的慢性疾病，可導(dǎo)致各種令人痛苦的癥狀，如瘙癢、睡眠障礙以及皮膚外觀改變等[1]。研究發(fā)現(xiàn)中藥治療濕疹具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但治療濕疹的中藥方劑很多，最常見的有三黃止癢洗劑、消風(fēng)散、除濕湯等。現(xiàn)階段，在濕疹治療中應(yīng)用中藥的研究已經(jīng)有很多，但其具體作用機(jī)制還沒有得到充分系統(tǒng)的研究，另外，在治療效果上還需要進(jìn)一步的提高[2-3]。白鮮皮是一種治療皮膚病的抗炎藥物，主要用于治療濕疹、特應(yīng)性皮炎和牛皮癬等皮膚病，其還具有殺蟲、止癢、清熱除濕等作用[4]。紫草油具有涼血、活血、解毒透疹、抗菌抗炎、抗過(guò)敏、抑制滲出及減少水腫等作用[5]。關(guān)于兩者聯(lián)合治療濕疹的作用機(jī)制報(bào)道尚少，本研究通過(guò)白鮮皮聯(lián)合紫草油治療大鼠濕疹的研究，初步探索其可能的作用機(jī)制，為有效治療濕疹提供科學(xué)理論依據(jù)。

材料和方法

1 材 料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組：40只健康SD大鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，使用許可證號(hào)：SYXK(川)2014-189。大鼠在條件為溫度(22℃～25℃)和濕度(35%～75%)，12 h晝夜光照交替，自由攝食飲水下養(yǎng)殖。大鼠被隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、白鮮皮組、紫草油組、白鮮皮聯(lián)合紫草油組，每組8只大鼠，大鼠每籠2只進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 大鼠濕疹模型制備：造模采用2，4-二硝基氯苯(DNCB)(成都科龍化工試劑廠)于大鼠背部皮膚造模[6]。具體方法為實(shí)驗(yàn)前1天大鼠背部去毛，面積約6 cm2，于第1天，用150 μl 1%DNCB溶解在丙酮：橄欖油混合物(3∶1v/v)中施用背部皮膚，于第5天，背部皮膚施用150 μl 0.2 %DNCB溶液[溶解在丙酮：橄欖油混合物(3∶1v/v)]，每周3次，共4周(第5～33天)?？瞻捉M大鼠背部皮膚施用相同量的丙酮橄欖油混合物(3∶1v/v)。觀察造模大鼠，如大鼠皮膚上出現(xiàn)瘙癢、紅斑/出血、水腫、剝蝕/糜爛和鱗屑/干燥等濕疹樣皮損表現(xiàn)，即為造模成功。

2 方 法

2.1 給藥方法：造模成功后第2天起開始給藥，空白組和模型組僅給予純凈水外洗，白鮮皮組：以濃度5 %的白鮮皮提取液(分別取白鮮皮藥材50 g加入1300 ml冷水中浸泡30 min后，煎煮約30 min至1000 ml，制備5 %的提取液)用注射器反復(fù)外洗背部皮膚5 s左右，每天2次，每次5 ml。紫草油組：以濃度100 %的紫草油(80℃加熱15～20 min，以紫草輕度變焦炭為度，待油冷卻后過(guò)濾)于背部皮膚外涂治療，2次/d。白鮮皮聯(lián)合紫草油組：先用5 %的白鮮皮提取液反復(fù)外洗背部皮膚5 s左右，后以100 %的紫草油外涂背部皮膚治療，2次/d。每組均連續(xù)治療12 d。白鮮皮、紫草均來(lái)自四川省中醫(yī)藥研究院。

2.2 樣本采集：末次給藥24 h后經(jīng)大鼠眼球取血2 ml，1500 r/min離心20 min，取出血清置于微量離心管內(nèi)，-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫粩囝i處死實(shí)驗(yàn)大鼠，取大鼠造模區(qū)皮膚組織，分成兩份，一份于4 %多聚甲醛固定，另一份于-80℃低溫保存，用于后續(xù)檢測(cè)。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 濕疹程度及嚴(yán)重度指數(shù)評(píng)分(Eczema area and severity index，EASI)：評(píng)分方法參考《濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)評(píng)分法》[7]。濕疹程度以水腫/丘疹、紅斑、滲出/結(jié)痂、剝脫/抓痕、苔蘚化為主要觀察表現(xiàn)。以0～3分計(jì)分濕疹表現(xiàn)的嚴(yán)重度，0分為無(wú)(仔細(xì)觀察后也不能確定)，1分為輕(需仔細(xì)觀察才能見到)，2分為中(此體征可立即看到)，3分為重(此體征非常明顯)，各種癥狀分值之間可記0.5分。

2.3.2 病理組織學(xué)觀察：將固定的皮膚組織按常規(guī)方法制備石蠟切片，HE染色，鏡檢觀察病理組織變化并拍照。

2.3.3 酶聯(lián)免疫法：ELISA檢測(cè)血清因子：采用ELISA試劑盒(上海茁彩)檢測(cè)大鼠血清中IFN-γ(貨號(hào)：ZC-36294)、IL-4(貨號(hào)：ZC-36402)、IL-31(貨號(hào)：ZC-32435)、LTB4(貨號(hào)：ZC-36369)、LTC4(貨號(hào)：ZC-36371)含量。

2.3.4 免疫組化檢測(cè)皮膚組織CysLTR1、CysLTR2表達(dá)：取固定后的大鼠皮膚組織，進(jìn)行洗滌、脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片在含有2 %明膠的溫水中漂浮，以防止樣品脫落，加一抗、二抗孵育，并用3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)為底物的Vectaain Elite ABC試劑盒(Vector)顯影，光鏡檢查，選擇陽(yáng)性物質(zhì)最明顯處5個(gè)視野，放大400倍，采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，Inc.公司)半定量檢測(cè)陽(yáng)性物質(zhì)的積分光密度(IOD)，計(jì)算平均IOD。

2.3.5 WB檢測(cè)皮膚組織中間絲聚合蛋白(FLG)、蛋白酶激活受體-2(PAR-2)、TRPV1含量：采用RIPA裂解液低溫提取總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白量，蛋白質(zhì)(10 μg)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分解，轉(zhuǎn)移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上。將膜封閉在5 %的脫脂牛奶中2 h，加入初級(jí)抗體孵育過(guò)夜：FLG、PAR-2、TRPV1(稀釋1∶1000)，用PBST洗滌膜，隨后用辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔抗體(1∶20000)在室溫下孵育2 h，PBST清洗膜，采集圖像并進(jìn)行軟件分析，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶A值的比值作為目的蛋白的表達(dá)含量。

結(jié) 果

1 不同處理組EASI評(píng)分 模型組大鼠較空白組EASI評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，白鮮皮組、紫草油組、白鮮皮聯(lián)合紫草油組皮損評(píng)分明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合用藥組EASI評(píng)分下降較單一用藥組明顯，表現(xiàn)紅斑、丘疹、抓痕/剝脫均減輕的現(xiàn)象,見表1。

表1 不同處理組EASI評(píng)分(分)

2 皮膚病理組織學(xué)觀察 空白組：組織結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)明顯異常。模型組：病理組織改變明顯，可見皮膚組織結(jié)構(gòu)充血模糊、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。白鮮皮組：可見組織結(jié)構(gòu)較清晰、局部可見充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。紫草油組：可見皮膚組織局部出現(xiàn)充血、水腫、局部結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)模糊，病理?yè)p傷較模型組減輕。白鮮皮聯(lián)合紫草油組：組織結(jié)構(gòu)清晰、水腫、充血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)少見，病理?yè)p傷較模型組明顯減輕，見圖1。

3 不同處理組血清因子 ELISA結(jié)果顯示，模型組較空白組IL-4、IL-31、LTB4、LTC4水平明顯升高，IFN-γ水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)不同處理治療，僅白鮮皮聯(lián)合紫草油組較模型組IL-4、IL-31、LTB4、LTC4水平明顯降低，IFN-γ水平較明顯升高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

圖1 不同處理組病理組織學(xué)觀察(HE染色，×400)

表2 不同處理組IFN-γ、IL-4、IL-31、LTB4、LTC4水平(pg/mg)

4 不同處理組皮膚組織CysLTR1、CysLTR2水平 與空白組比較模型組大鼠CysLTR1、CysLTR2水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)不同處理治療，僅白鮮皮聯(lián)合紫草油組較模型組CysLTR1、CysLTR2水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3，圖2。

5 不同處理組皮膚組織FLG、PAR-2、TRPV1含量 WB結(jié)果顯示，模型組較空白組PAR-2、TRPV1水平明顯升高，F(xiàn)LG水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)不同處理治療，僅白鮮皮聯(lián)合紫草油組較模型組PAR-2、TRPV1水平明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)LG水平較模型組升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，圖3。

表3 不同處理組CysLTR1、CysLTR2水平(n=8)

圖2 免疫組化圖(×400)

圖3 不同處理組FLG、PAR-2、TRPV1含量

討 論

AE是臨床常見的表皮及真皮淺層的炎癥性皮膚科常見病，典型表現(xiàn)為持續(xù)性瘙癢、紅腫、浸潤(rùn)、增厚、粗糙等，發(fā)病時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究認(rèn)為主要由代謝異常、內(nèi)分泌失調(diào)、患者自身消化系統(tǒng)疾病、外部環(huán)境中的病毒和細(xì)菌以及溫濕度和異物過(guò)敏原的刺激等因素引起[8]，造成了一定程度的治療困難。并且，糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期應(yīng)用可出現(xiàn)皮膚萎縮、色素沉著、毛細(xì)血管擴(kuò)張、系統(tǒng)吸收、快速抵抗等副作用，且停藥易復(fù)發(fā)，因此限制了激素的長(zhǎng)期應(yīng)用和用量，目前如何提高臨床療效、抑制復(fù)發(fā)和預(yù)防發(fā)生不良反應(yīng)等已經(jīng)成為近年來(lái)臨床治療濕疹的熱點(diǎn)。因此，以中藥治療濕疹為切入點(diǎn)，對(duì)中醫(yī)藥治療濕疹的作用機(jī)理進(jìn)行研究，為中醫(yī)藥在臨床濕疹治療中的應(yīng)用指導(dǎo)提供新的思路。天然產(chǎn)物萜類化合物具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗癌、抗血管生成、抗真菌和抗乙肝病毒活性，這使得對(duì)這類成分的植物化學(xué)或生物活性研究具有重要意義，白鮮皮根皮屬于蕓香科植物，是一種富含型半萜類的植物，作為一種傳統(tǒng)中藥，在中國(guó)幾千年來(lái)，由于其止癢、清熱和祛濕的能力，它被廣泛用于治療炎癥、微生物感染、外陰瘙癢、濕疹、疥瘡、癌癥和其他疾病。此外，還能有效抑制高脂飲食引起的體重和脂肪含量增加，降低血液中甘油三酯(TG)和總膽固醇含量，減輕肥胖，并具有殺蟲作用。

先前的研究表明，中藥不僅可以治療胃炎、胃潰瘍、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等；中藥在AE治療方面具有治療效果顯著、治療組分及靶標(biāo)途徑多的特點(diǎn)，在應(yīng)用于AE治療上已成為研究熱點(diǎn)[9-11]。因此從這一點(diǎn)出發(fā)，建立急性濕疹大鼠模型，對(duì)急性濕疹進(jìn)行中藥治療，以尋找更有效的中藥治療濕疹方法，并通過(guò)試驗(yàn)研究中藥治療濕疹的作用機(jī)制。白鮮皮性味苦、寒；歸胃、脾、膀胱經(jīng)，其具有祛風(fēng)、清濕、解毒等功能，多用于風(fēng)/濕疹、瘡毒濕熱、風(fēng)濕熱痹、疥癬瘡癩、黃疸尿赤等，具有多重藥效藥理作用[12]。紫草性味咸、甘、寒，歸肝、心兩經(jīng)，其具有活血、清熱、透疹、解毒等功能。紫草素及其衍生物是紫草的主要化學(xué)成分，在抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等方面具有較為廣泛的生物活性，在各種皮膚病治療中應(yīng)用廣泛，并取得了一定療效[13]。

至今為止，濕疹的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，在免疫炎癥性反應(yīng)中，Th1/Th2亞群及其相互之間的平衡在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用。研究指出，當(dāng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)被激活，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th1細(xì)胞，其進(jìn)一步產(chǎn)生的炎癥因子對(duì)靶器官造成一定的損害，從而導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。除了Th1和Th2細(xì)胞外，其他T細(xì)胞亞型包括Th17和Th22細(xì)胞也在皮炎與濕疹的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[14]。細(xì)胞因子主要由Th1、Th2分泌，其分泌異常在AE的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)IL-31、IFN-γ、IL-4、LTB4、LTC4水平與濕疹相關(guān)，IL-31水平在AE患者皮損處明顯上調(diào)，可引起皮膚炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、瘙癢[16]。LTB4、LTC4、CysLTR1、CysLTR2水平在AE患者中明顯升高[17]。LTB4、LTC4可使白細(xì)胞趨化作用引起皮膚表現(xiàn)出紅斑、腫脹、滲出，其引起的皮損表現(xiàn)，中醫(yī)多辨證為濕熱蘊(yùn)膚證[18]?？梢奓TB4、LTC4、CysLTR1、CysLTR2水平升高參與AE皮損表現(xiàn)，而中醫(yī)藥治療AE達(dá)到清熱、燥濕、止癢的機(jī)制可能與抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及下調(diào)LTB4、LTC4水平及其受體的表達(dá)相關(guān)。AE所致的皮膚瘙癢常由內(nèi)源性及外源性化學(xué)物質(zhì)介導(dǎo)的多條信號(hào)通路共同傳遞。編碼絲聚蛋白原的主要基因FLG減少可導(dǎo)致保濕因子的大量減少?gòu)亩鹌つw干燥、粗糙，最終致使皮膚受損引起皮膚屏障功能異常[19]。目前認(rèn)為皮膚瘙癢發(fā)生的一條主要途徑為非組胺依賴的PAR-2途徑，其下游信號(hào)分子是TRPV1，是癢覺通路傳遞的樞紐，PAR-2廣泛表達(dá)于人體皮膚上，AE發(fā)生時(shí)，PAR-2被活化可破壞皮膚屏障功能，PAR-2被激活后最后會(huì)致使下游TRPV1通道開放，增加TRPV1活性誘導(dǎo)產(chǎn)生癢覺[20]。因此，抑制PAR-2/TRPV1信號(hào)通路激活，對(duì)延緩AE發(fā)展具有重要意義。

本研究表明，白鮮皮聯(lián)合紫草油可調(diào)節(jié)急性濕疹大鼠Th1/Th2細(xì)胞分泌，減少細(xì)胞因子IL-31、IL-4水平，抑制PAR-2、TRPV1表達(dá)，其機(jī)制可能是通過(guò)PAR-2/TRPV1信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，發(fā)揮治療急性濕疹瘙癢的作用。