王 蒙， 王倩倩， 孫連慶△

1.西安交通大學(xué)(西安 710049)；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院(西安 710061)

高血糖毒性是糖尿病周圍神經(jīng)病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，控制血糖是目前治療糖尿病并發(fā)癥的主要手段，然而，大規(guī)模的臨床試驗(yàn)顯示，對(duì)于病程較長或已經(jīng)發(fā)生并發(fā)癥的糖尿病患者，即使以后將血糖控制在正常范圍并不能降低微血管并發(fā)癥的發(fā)生，這種現(xiàn)象稱之為“代謝記憶”[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)：氧化應(yīng)激在代謝記憶效應(yīng)的產(chǎn)生中起主導(dǎo)作用?；钚匝醯拇罅坷鄯e可導(dǎo)致線粒體DNA損傷，誘發(fā)細(xì)胞凋亡及炎性損傷，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的持續(xù)發(fā)展[4-5]。

中醫(yī)上認(rèn)為糖尿病并發(fā)癥是由于糖尿病長期存在，量變達(dá)到質(zhì)變的過程，就會(huì)導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的產(chǎn)生。奚九一認(rèn)為消渴日久，傷及氣血津液，筋脈失養(yǎng)，這是糖尿病并發(fā)癥本虛的基礎(chǔ)。糖尿病后期多損及脾腎，脾腎失司，水谷精微不化且不運(yùn)，不能布散于肢體筋脈，也不能蘊(yùn)養(yǎng)五臟，就會(huì)產(chǎn)生風(fēng)、痰、濕、瘀等邪氣，外邪入侵，內(nèi)邪作亂，就會(huì)產(chǎn)生糖尿病并發(fā)癥或使其加重[6-7]。胡筱娟認(rèn)為，糖尿病并發(fā)癥與體質(zhì)、飲食、精神、吸煙等因素有關(guān)[8]。呂萍根據(jù)其多年臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為脈絡(luò)閉塞、氣血瘀滯是糖尿病并發(fā)癥產(chǎn)生的關(guān)鍵[9]。

丹參中的化學(xué)成分有很多種，其中最有效且研究最熱的就是丹酚酸B，丹酚酸B是丹參的有效水溶性成分，具有清除自由基、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎的作用。其可增加被高糖抑制的神經(jīng)細(xì)胞的增值活性，減少氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡[10]。然而在代謝記憶環(huán)境下，丹酚酸B是否能夠清除自由基，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡呢？本研究在代謝記憶環(huán)境下，觀察丹酚酸B是否能夠下調(diào)ROS水平，降低凋亡及炎性相關(guān)蛋白的表達(dá)。

材料和方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：大鼠雪旺細(xì)胞系細(xì)胞(Rat Schwann cell line)RSC96一種永生化的大鼠雪旺細(xì)胞，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC(American type culture collection),由陜西藩?jiǎng)偕锟萍加邢薰旧虾＾k代為采買。

1.2 藥品試劑：D-葡萄糖、丹酚酸B、低糖培養(yǎng)基、高糖培養(yǎng)基(Hyclone,美國)，活性氧(ROS)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司，中國)；兔抗大鼠Cleaved-caspase 9、Cleaved-caspase 3、P65、抗體(CST,美國)；IL-1β(Immunoway,中國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：CO2培養(yǎng)箱(上海普美達(dá)儀器有限公司，中國)；倒置相差顯微鏡(Olympus,日本)；臺(tái)式高速離心機(jī)(蘇州華宇凈化設(shè)備有限公司，中國)；酶標(biāo)儀(BioTek,美國)；流式細(xì)胞儀(BD Biosciences公司，美國)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代：復(fù)蘇RSC 96細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(10%)、雙抗，2～3 d換液1次。待細(xì)胞長至瓶底80%～90%，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，3～5 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行此次實(shí)驗(yàn)。

2.2 流式檢測ROS：按照5×104/孔的密度接種于6孔板，將實(shí)驗(yàn)分為低糖組(5.6 mmol/L)，代謝記憶組(125 mmol/L高糖作用48 h，5.6 mmol/L低糖作用24 h)丹酚酸B組(125 mmol/L高糖+丹酚酸B 1 μmol/L作用48 h，5.6 mmol/L低糖+丹酚酸B1 μmol/L作用24 h)作用70 h，加入DCFH-DA 10 μmol/L作用2h，胰酶消化并收集細(xì)胞于流式機(jī)按照激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長525 nm進(jìn)行檢測。

2.3 Western blot 檢測凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)：加入不同條件作用72 h，各組細(xì)胞標(biāo)本加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，將含有40 μg蛋白上清液電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并將含5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，一抗(Cleaved-caspase 9、Cleaved-caspase 3、P65、IL-1β)過夜孵育，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，采用ECL試劑盒進(jìn)行檢測，采用Image-pro圖像分析定量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)選用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)形式記錄，采用One Sample Kolmoglrov- Smirnov Z test檢測數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，非正態(tài)分析數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法(K個(gè)獨(dú)立樣本的檢驗(yàn))。各種檢驗(yàn)的顯著性水平均設(shè)定為α=0.05。

結(jié) 果

1 丹酚酸B降低ROS含量 流式檢測低糖組(5.6 mmol/L)、代謝記憶組(125 mmol/L高糖作用48 h，5.6 mmol/L低糖作用24 h)及丹酚酸B組(125 mmol/L高糖+丹酚酸B 1 μmol/L作用48 h，5.6 mmol/L低糖+丹酚酸B 1 μmol/L作用24 h)ROS含量，結(jié)果顯示如圖1。相較于對(duì)照組，代謝記憶組ROS含量明顯增加；相較于代謝記憶組，丹酚酸B組ROS含量明顯下降(P<0.05)，提示代謝記憶環(huán)境可激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，丹酚酸B可抑制這一過程。

2 丹酚酸B降低RSC96細(xì)胞凋亡及炎性相關(guān)蛋白的表達(dá) 免疫印跡法檢測凋亡及炎性相關(guān)蛋白(Cleaved-caspase 9、Cleaved-caspase 3、P65、IL-1β)的表達(dá)，結(jié)果顯示如圖2。相較于對(duì)照組，代謝記憶組Cleaved-caspase 9、Cleaved-caspase 3、P65、IL-1β表達(dá)增加(P<0.05)；相較于代謝記憶組，丹酚酸B組Cleaved-caspase 9、Cleaved-caspase 3、P65、IL-1β表達(dá)水平下降(P<0.05)，提示代謝記憶環(huán)境可誘發(fā)RSC96細(xì)胞凋亡及炎性損傷，丹酚酸B可抑制這一過程的發(fā)生。

討 論

糖尿病周圍神經(jīng)病變是最常見糖尿病慢性并發(fā)癥之一，隨著病程的延長，其發(fā)病率可高達(dá)90%以上[11]。目前，控制血糖是治療糖尿病及其并發(fā)癥的重要手段。最新研究發(fā)現(xiàn)：機(jī)體內(nèi)存在高糖“代謝記憶”效應(yīng)，因此，以控制血糖為重點(diǎn)的治療方法無法有效阻止糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展，如何正確認(rèn)識(shí)并阻止“代謝記憶”效應(yīng)成為目前防治糖尿病周圍神經(jīng)病變的主要方向。

氧化應(yīng)激是觸發(fā)細(xì)胞凋亡的重要發(fā)病機(jī)制。細(xì)胞凋亡，是多因素參與觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞主動(dòng)性死亡。研究發(fā)現(xiàn)：氧化應(yīng)激所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡是“代謝記憶”的重要發(fā)病機(jī)制。在高糖培養(yǎng)的原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡率明顯增加，當(dāng)解除高糖后，細(xì)胞凋亡仍然持續(xù)，提示高糖是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要因素，且內(nèi)皮細(xì)胞受到高糖“代謝記憶”效應(yīng)的持續(xù)影響[12]。不僅如此，研究發(fā)現(xiàn)：氧化應(yīng)激所誘發(fā)炎性損傷是高糖“代謝記憶”效應(yīng)的重要發(fā)病機(jī)制。在早期的異常糖代謝環(huán)境中，免疫炎癥可通過氧化應(yīng)激直接損傷細(xì)胞，也可隨著病程的進(jìn)展，其脂毒性、糖毒性和糖基化終產(chǎn)物的形成導(dǎo)致基因表達(dá)、細(xì)胞蛋白水平發(fā)生功能性和結(jié)構(gòu)性的改變，最終引起糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生[13]。在這一過程中，白介素(Inter leukin,IL)家族、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、Toll 樣受體-4 (TLR4)、單核細(xì)胞趨化蛋白 1 (MCP-1)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等炎癥細(xì)胞因子及其引發(fā)的慢性炎癥免疫反應(yīng)在糖尿病代謝記憶的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位。

圖1 丹酚酸B減輕高糖代謝記憶對(duì)RSC96細(xì)胞的損傷(A：對(duì)照組；B：代謝記憶組；C：丹酚酸B組；D：三組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析)

圖2 丹酚酸B減輕高糖代謝記憶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及炎性損傷(A：Cleaved-caspase 9蛋白統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；B：Cleaved-caspase 3 蛋白統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C：P65蛋白統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；D：IL-1β蛋白統(tǒng)計(jì)學(xué)分析)

Infante-Garcia C等[14]研究發(fā)現(xiàn)：在牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BREC)中，由高血糖誘導(dǎo)的NF-κB在血糖水平恢復(fù)正常后仍然升高，表明NF-κB影響相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑保持活化狀態(tài)，并導(dǎo)致細(xì)胞代謝記憶效應(yīng)。Natarajan等[15]發(fā)現(xiàn)從9～11周雄性db/db小鼠分離出的血管平滑肌細(xì)胞，炎性基因、MCP-1、IL-1β處于高表達(dá)狀態(tài)，在血糖恢復(fù)8周后的，炎癥因子仍持續(xù)存在，說明高糖狀態(tài)被糾正的情況下，炎癥因子的持續(xù)存在與“代謝記憶”之間存在重要的聯(lián)系。Chan等[16]發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠視網(wǎng)膜中炎性細(xì)胞因子IL-18、TNF-α，細(xì)胞黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)和誘導(dǎo)型氮氧化物合酶(iNOS)等促炎因子表達(dá)增加，而血糖恢復(fù)至正常水平后這些炎性因子并未降低。 Kowluru等[17]也觀察到高糖刺激可以引起視網(wǎng)膜周細(xì)胞中IL-1β、NF-κB、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、TNF-α和ICAM-1等炎癥因子的升高，且這些升高的炎癥因子并不能在血糖恢復(fù)正常后下調(diào)。

現(xiàn)代中醫(yī)理論認(rèn)為糖尿病周圍神經(jīng)病變是本虛標(biāo)實(shí)之病[18-19]，最終導(dǎo)致DPN等糖尿病嚴(yán)重慢性并發(fā)癥的產(chǎn)生。而丹參的特性和功能完全可以與之對(duì)接，古代早已應(yīng)用丹參治療下肢疾患，下肢軟弱無力、疼痛等癥狀，服用丹參后立見效果，癥狀全消，故古人稱之為“奔馬草”，服后猶如馬兒一樣能奔善跑。因此，丹參應(yīng)用于糖尿病周圍神經(jīng)病變的研究成為了相對(duì)較熱的中藥之一。而丹酚酸B作為丹參中的有效成分，根據(jù)文獻(xiàn)中記載，其可以用于DPN的治療，而丹參是通過哪種途徑來治療DPN的，目前還是在不斷發(fā)現(xiàn)當(dāng)中。筆者通過查閱文獻(xiàn)認(rèn)為，保護(hù)下肢末梢神經(jīng)，促進(jìn)末梢神經(jīng)的神經(jīng)內(nèi)分泌的功能正常運(yùn)行，是丹參治療DPN的一個(gè)重要途徑。因此，筆者做了實(shí)驗(yàn)來證實(shí)這個(gè)猜測。

綜上認(rèn)為，丹酚酸B可能通過抑制細(xì)胞凋亡及炎性損傷保護(hù)周圍神經(jīng)細(xì)胞，但是現(xiàn)有研究僅在體外研究揭示高糖代謝記憶的發(fā)病機(jī)制。在今后的工作中可進(jìn)一步通過在體研究印證丹酚酸B對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用。