何梅俊，陳霜霜，任晶紅，賈 佳

蘇州大學藥學院(蘇州 215123)

氧化應激損傷由活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)造成。ROS包括過氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH-)和超氧陰離子(O2-)等。體內(nèi)氧自由基代謝失衡導致ROS蓄積，攻擊機體，導致機體組織脂質(zhì)過氧化水平升高，引起DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)的表達異常[1-2]。氧化應激是腦卒中的主要病理機制[3]。缺血性卒中的發(fā)生是由于血栓阻斷了血液對腦的供應,而血流恢復后導致的再灌注損傷與自由基的產(chǎn)生過多或體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡相關。研究表明，再灌注過程中大量產(chǎn)生ROS：在缺血階段，O2和葡萄糖的缺少導致谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的反向轉(zhuǎn)運，導致谷氨酸的釋放和谷氨酸興奮性毒性[4]；缺氧則導致腦內(nèi)酸中毒[5]。在缺血再灌注期間ROS大量生產(chǎn)，NO也過量生成，它與O2-反應生成活性更強的過氧亞硝基陰離子(ONOO-)，使缺血再灌注的氧化應激損傷增強。同時，超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶的功能障礙可能損害內(nèi)源性抗氧化防御機制，進一步加劇氧化應激和缺血再灌注損傷[6-7]。受損組織進一步受到炎癥反應的損傷或被免疫細胞浸潤從而導致死亡[8]。目前對氧化應激損傷的調(diào)控機制還缺乏深入了解。

microRNA是一類高度保守的非編碼、單鏈、小RNA(≈22 nt)。動物細胞內(nèi)，miRNA與靶基因mRNA分子的3’端非編碼區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)互補配對后，通過降解與其互補配對的mRNA或抑制其翻譯從而參與靶基因表達的調(diào)控。miRNA在生長、發(fā)育、凋亡以及人類疾病方面起著重要作用[9-11]。有文獻報道，miR-125b在心肌中的表達增加顯著降低了心肌梗塞面積，并阻止了缺血再灌注(I / R)誘發(fā)的心臟功能障礙。這些機制涉及抑制I / R誘導的NF-κB活化和預防心肌中I / R活化的p53介導的凋亡信號傳導[12]。但是，目前尚不清楚miR-125b是否對氧化應激損傷具有調(diào)控作用。

血紅素加氧酶-1(Hemeoxygenase-1, HO-1)也稱為32-熱休克蛋白(Hsp32)。氧化應激和其他有害刺激在腦或其他組織中可迅速誘導HO-1的表達[13]。研究表明，HO-1在多種氧化損傷模型中具有保護作用，有一定抗氧化作用。錳超氧化物歧化酶(Mn SOD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)線粒體中重要的抗氧化物酶，主要作用是清除活性氧自由基，延緩衰老和對抗癌癥。已有實驗結(jié)果表明腦損傷和腦缺血組織中Mn SOD能夠過量表達，清除細胞內(nèi)過量的自由基，具有重要的神經(jīng)保護作用。本文通過建立體外神經(jīng)元氧化應激模型，在該模型中觀察過氧化氫刺激后miR-125b表達水平變化，并探討miR-125b是否能夠上調(diào)HO-1和Mn SOD的表達、以及是否對氧化應激損傷具有保護作用。

材料與方法

1 材 料 DEME培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；青霉素/鏈霉素(Hyclone公司)；H2O2(美國 Sigma 公司)；MTT(碧云天生物科技有限公司)；RNAiso Plus，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green(寶生物工程有限公司)；MiR 125b-5p類似物和對照類似物(廣州銳博生物科技有限公司)。HT22細胞來自本實驗室。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)及傳代：將HT22細胞復蘇后，于含有10%胎牛血清以及1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。之后將細胞放置于溫度為37℃以及CO2含量為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察細胞狀態(tài)，選擇狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期細胞進行傳代培養(yǎng)，細胞面積占據(jù)培養(yǎng)皿80%時可用于下一步的實驗。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染：使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染NC mimic和miR125b-5p mimic。以24孔為例，稀釋Lipofectamine 2000，將2 μl Lipofectamine 2000和50 μl Opti-MEM混勻，靜置5 min。稀釋miRNA類似物，取2 μl miR125b-5p NC/mimic和50 μl Opti-MEM，輕輕混勻后靜置，將兩種混合物混勻后加入細胞板相應孔中。24 h后采用RT-qPCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率，進行后續(xù)試驗。

2.3 MTT法測細胞活力：將狀態(tài)良好的HT22神經(jīng)元細胞以2×104/孔的密度接種于96孔板中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。miR125b-5p mimic和NC轉(zhuǎn)染細胞24 h后，造氧化應激模型，24 h后棄培養(yǎng)基，加入10 μl MTT溶液(5mg/ml)，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應4 h后棄去孔內(nèi)液體，再加入100 μl的DMSO用以充分溶解結(jié)晶，置于脫色搖床上低速震蕩。在全自動酶標儀中檢測570 nm條件下的吸光度，以此定量反映細胞的活性。

2.4 實時熒光定量PCR(qPCR)：收集HT22細胞，棄培養(yǎng)基，用預冷PBS洗滌3次，加入1ml RNAiso Plus，冰上裂解5 min，收集液體，參照Takara公司RNAiso Plus試劑盒說明書提取細胞中的總RNA。檢測RNA的濃度，取1 μg RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)Takara公司RT-PCR 反應試劑盒說明書配置混合物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。稀釋cDNA，將1.5 μl cDNA與8.5 μl的引物、DEPC水和SYBR Green混合液混勻，每組設置3個復孔，封膜后上機，在ABI Step One Plus PCR 儀上進行實時熒光定量PCR檢測。反應條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s(循環(huán)40次)。以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 引物序列表

結(jié) 果

1 miR125b-5p在H2O2刺激HT22細胞中表達下調(diào) 采用體外培養(yǎng)HT22海馬神經(jīng)元細胞，造過氧化氫誘導神經(jīng)元氧化應激模型，研究miR125b-5p在氧化應激損傷中的作用。首先用H2O2(800 μmol/L)刺激HT22細胞24 h后，提取miRNA，采用RT-qPCR的方法檢測miR125b-5p的表達變化。結(jié)果表明，H2O2刺激HT22細胞24h后，與正常對照組相比，miR125b-5p的表達水平明顯下降(圖1)。

圖1 miR125b-5p在H2O2刺激HT22神經(jīng)元細胞中的表達

2 過表達miR125b-5p顯著提高H2O2誘導的HT22細胞存活率 圖1實驗結(jié)果表明氧化應激可顯著下調(diào)miR125b-5p表達，而后我們利用HT22神經(jīng)元細胞來研究miR125b-5p對H2O2誘導神經(jīng)元氧化損傷的保護作用。利用脂質(zhì)體分別將miR 125-5p的類似物(miR125b-5p mimics)轉(zhuǎn)染入細胞實現(xiàn)其過表達，24h后，收集細胞，通過RT-qPCR方法檢測其過表達效率。如圖2A所示，和陰性對照類似物(NC mimics)相比，miR125b-5p mimics組中miR125b-5p表達水平顯著升高。轉(zhuǎn)染24h后，利用H2O2處理HT22細胞24h，模擬體外氧化應激模型，隨后采用MTT法檢測細胞活力。如圖2B所示，相對于正常對照組，H2O2刺激過后細胞活力明顯下降，而相對于陰性對照組，過表達miR125b-5p組的細胞存活率明顯上升。

3 過表達miR 125b-5p增加H2O2誘導神經(jīng)元中抗氧化酶的表達 氧化應激損傷會誘導抗氧化酶的表達，為了探究miR125b-5p對神經(jīng)元的氧化應激保護作用的機制是否和調(diào)控抗氧化酶表達有關，我們利用q-qPCR技術，檢測氧化應激損傷后細胞內(nèi)HO-1和Mn SODmRNA的表達水平。結(jié)果如圖3所示，相對于正常對照組，H2O2刺激后HT22神經(jīng)元細胞中HO-1、Mn SOD的mRNA表達水平略有升高，而相對于陰性對照組(NC mimic)，過表達miR125b-5p組(miR125b-5p mimics)上調(diào)H2O2誘導HT22神經(jīng)元細胞中HO-1、Mn SOD的mRNA表達水平。

圖2 過表達效率及MTT細胞活力測定結(jié)果(與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01)

圖3 過表達miR125b-5p上調(diào)H2O2誘導HT22細胞中抗氧化因子的表達

討 論

據(jù)統(tǒng)計全球每年因腦卒中喪命將近有550萬人，4400萬人因中風致殘，到2020年人數(shù)達6100萬[14]。我國每年發(fā)病約200萬人，死亡約150萬人，存活的患者中，約四分之三不同程度喪失勞動能力，重度致殘者占40%。腦卒中以缺血性卒中為主，可將其細分為血栓性卒中或腦栓塞。目前只有美國FDA批準通過靜脈注射組織纖溶酶原激活物用來治療急性缺血性卒中，在卒中發(fā)生的4.5h內(nèi)這種激活物可以溶解血栓或者重通，但由于治療窗較短，僅有很少一部分病人(<5%)能接受這種治療[15]。因此，急需開發(fā)新的腦缺血治療藥物并應用于臨床。

在腦缺血后神經(jīng)元損傷中氧化應激損傷起到了至關重要的作用，大量自由基可誘導脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸的過氧化對細胞造成直接損傷，還可以通過DNA損傷、線粒體途徑及轉(zhuǎn)錄因子等途徑導致細胞凋亡[16]。由此引發(fā)一系列效應加重腦損傷。因此，氧化應激損傷是造成腦缺血再灌注損傷的重要原因。但目前對于氧化應激損傷的調(diào)控機制還缺乏深入研究。

microRNA是一類高度保守的非編碼小RNA(≈22 nt)，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控。miRNA與靶基因mRNA分子的3’端非編碼區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)互補配對后，通過降解與其互補配對的mRNA或抑制翻譯從而參與靶基因表達的調(diào)控。miRNA的編碼基因在細胞核內(nèi)先由RNA聚合酶Ⅱ產(chǎn)生較長的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri-miRNA，中間有一段不完美配對的莖-環(huán)結(jié)構，而后通過RNaseⅢ核酸內(nèi)切酶Drosha酶和雙鏈RNA結(jié)合蛋白Pasha蛋白或DiGeorge關鍵區(qū)域8(RNA binding protein DiGeorge critical region-8，DGCR8)的作用分裂釋放miRNA前體(precursor miRNA，pre-miRNA)。miRNA前體長度為60～70nt且?guī)в星o環(huán)結(jié)構，它由Ran-GTP依賴的輸出蛋白-5(Exportin-5)運出細胞核進入胞質(zhì)基質(zhì)中。胞質(zhì)基質(zhì)中的RNaseⅢ(即Dicer酶)識別pre-miRNA的雙鏈，將其剪切成成熟的雙鏈miRNA。而后解鏈為兩條單鏈，一條被降解，一條結(jié)合RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)。而后，microRNA通過兩種機制發(fā)揮功能：首先是裝載成RISC后使互補配對的mRNA降解；其次，miRNA可抑制mRNA的翻譯，降低靶基因的蛋白水平但不影響其mRNA水平。

已被報道的人源miRNA有1527種以及鼠源miRNA有741種[17]，而已建立的數(shù)據(jù)庫可用于搜索miRNA序列及其靶基因[18]。有研究表明，miR-145、miR-124等miRNA都可能與腦缺血的發(fā)病有一定關系，其中抑制miR-145可顯著上調(diào)SOD-2的表達，而miR-124a則有可能成為腦缺血的一個治療靶點[19-20]。已有的研究發(fā)現(xiàn)有多種miRNA在腦缺血再灌注損傷中有表達變化差異，在神經(jīng)元的存活、發(fā)育、分化等方面發(fā)揮著重要作用。microRNA lin-4是第一個被發(fā)現(xiàn)的miRNA，是調(diào)控線蟲胚胎后期發(fā)育的重要基因[21]。microRNA-125b(miR-125b)是lin-4的同系物。目前已有研究表明miR-125在心肌缺血再灌注損傷中起到保護作用，但具體機制仍需進一步研究。因此，本實驗將探討miR-125b-5p對神經(jīng)元氧化應激損傷是否具有保護作用。

在本實驗中，首先我們采用H2O2刺激HT22海馬神經(jīng)元細胞構建氧化應激模型，H2O2處理后，提取miRNA，采用q-PCR方法檢測miR125b-5p的表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化應激損傷后miR125b-5p的表達明顯下降。為進一步研究miR125b-5p對H2O2誘導神經(jīng)元是否具有保護作用，我們將miR125b-5p的類似物(miR125b-5p mimics)及其陰性對照(NC)轉(zhuǎn)染到細胞中，實現(xiàn)miR125b-5p過表達，隨后造氧化應激模型，采用MTT法檢測細胞活力，結(jié)果顯示miR125b-5p過表達明顯提高H2O2刺激后神經(jīng)元細胞存活率。這些結(jié)果提示miR125b-5p對神經(jīng)元氧化應激損傷具有一定保護作用。

HO-1、Mn SOD與清除自由基，保護氧化應激導致的細胞、組織損傷有一定的關系。目前普遍認為HO-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平在細胞和組織中上調(diào)，可以保護由氧化應激引起的細胞、組織損傷。有研究表明，大鼠肝硬變模型中HO-1可以通過抗氧化應激作用保護肝缺血再灌注損傷[21]。Mn SOD是中樞神經(jīng)系統(tǒng)線粒體中重要的抗氧化物酶，主要作用是清除活性氧自由基，抗癌癥和延緩衰老。已有實驗結(jié)果表明腦損傷和腦缺血組織中Mn SOD能夠過量表達，清除細胞內(nèi)過量的自由基，具有重要的神經(jīng)保護作用。為了探究miR125b-5p在過氧化氫刺激神經(jīng)元細胞后對抗氧化酶HO-1和Mn SOD的表達水平的影響，我們將miR125b-5p的類似物(miR125b-5p mimics)或?qū)φ?NC mimics)轉(zhuǎn)染到細胞中，用H2O2刺激，采用RT-qPCR技術，檢測HO-1和Mn SOD的mRNA表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與NC組相比，過表達miR125b-5p組細胞抗氧化酶HO-1、Mn SOD的mRNA表達水平顯著升高。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)miR125b-5p在體外神經(jīng)元細胞模型中對氧化應激損傷有一定的保護作用，其作用機制可能與上調(diào)控抗氧化酶如HO-1、Mn SOD的表達水平有關。下一步我們將深入研究miR125b-5p在腦缺血氧化應激損傷中的作用及具體作用機制，為研發(fā)治療腦缺血的新型藥物提供一定理論依據(jù)。