吳利軍 李佳琳 陳夏冰 萬平民 邵志勇 何斌 楊文海 陳潔 金爾光 潘中寶 童偉文 周源 劉武

摘要：為了解奶牛乳房炎病原菌的菌群分布及耐藥性情況，對(duì)湖北省一奶牛場(chǎng)開展為期1年的病原菌分離鑒定和耐藥性研究。結(jié)果表明，從165份乳樣中共分離鑒定出9個(gè)科16個(gè)屬的235株病原菌。其中葡萄球菌83株，占35.0%;中型無綠藻36株，占13.5%;魯氏不動(dòng)桿菌28株，占11.9%;大腸桿菌12株，占5.1%;停乳鏈球菌7株，占2.9%;其他病原菌占31.6%。耐藥試驗(yàn)結(jié)果顯示，20株分離菌對(duì)測(cè)試的14種抗菌藥物均產(chǎn)生不同程度耐藥性，最少對(duì)1種藥物產(chǎn)生耐藥性，最多達(dá)到14種。敏感性最高的抗菌藥物為氟苯尼考，敏感率達(dá)到75%。研究結(jié)果可為奶牛乳房炎的防控和臨床用藥提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：奶牛乳房炎;病原菌;分離鑒定;耐藥性

中圖分類號(hào)：S857.2+6? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）21-0145-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.21.031

Abstract： In order to understand the microflora distribution and drug resistance of the pathogenic bacteria of cow mastitis， a one-year pathogen isolation and identification and drug resistance study was conducted in a dairy farm in Hubei Province. The results showed that 235 strains of pathogens belonging to16 genera of 9 families were isolated from 165 milk samples. Among them， 83 strains were Staphylococcus， accounting for 35%; 36 strains were Protothecazopfii， accounting for 13.5%; 28 strains were Acinetobacterrubrum， accounting for 11.9%; 12 strains were Escherichia coli， accounting for 5.1%; 7 strains were Streptococcusdysgalactiae， accounting for 2.9%; and other strains accounting for 31.6%. The results of drug resistance test showed that 20 isolates had different degrees of drug resistance to the 14 antibiotics tested. The pathogen is resistant to at least one drug， and the highest is resistant to 14 drugs. The most sensitive antibiotic is florfenicol， with a sensitive rate of 75%. The results provide a fundamental data for the prevention and control the dairy cow mastitis and clinical medication.

Key words： cow mastitis; pathogenic bacteria; isolation and identification; drug resistance

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中的一種常見病和多發(fā)病，會(huì)導(dǎo)致奶牛泌乳量下降，影響乳制品質(zhì)量，進(jìn)而危害食品衛(wèi)生和安全，是影響奶牛業(yè)發(fā)展的主要疾病之一[1]。全世界約有2.2億頭奶牛，其中近1/3的奶?；加懈鞣N類型的乳房炎，每年因乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失超過350億美元[2]，中國(guó)每年因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失約1.35億元[3]。奶牛乳房炎根據(jù)臨床癥狀分為隱性乳房炎和臨床型乳房炎[4]。隱性乳房炎患病奶牛沒有明顯的臨床癥狀，觀察不到炎癥反應(yīng)，乳汁外觀無明顯變化，但乳制品卻發(fā)生實(shí)質(zhì)性的改變。臨床型乳房炎患病奶牛的乳腺一般有紅腫、局部發(fā)熱，接觸有痛感以及乳汁黏稠，結(jié)塊或呈水樣等異常變化。臨床上大多數(shù)奶牛乳房炎處于隱性狀態(tài)，占發(fā)病總數(shù)的75%～95%，對(duì)奶牛業(yè)造成的危害更大且更加普遍。引起奶牛乳房炎的因素較多，其中病原微生物感染是主要病因。已發(fā)現(xiàn)150多種病原微生物能夠引起奶牛乳房炎，其中以葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主[5]。奶牛乳房炎的防治以抗菌藥物治療為主，隨著抗生素的長(zhǎng)期使用，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐受性也隨之增強(qiáng)，給奶牛乳房炎的防治帶來新的挑戰(zhàn)[6]。為了使奶牛乳房炎的防治措施更加有效，必須對(duì)奶牛乳房炎病原菌的流行和耐藥性有全面的認(rèn)識(shí)和了解。本研究對(duì)湖北一牛場(chǎng)展開為期1年的奶牛乳房炎病原菌的分離、鑒定工作，并對(duì)主要病原菌進(jìn)行耐藥性研究，以期為制訂科學(xué)、合理的奶牛乳房炎治療方案提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 主要試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、藥敏紙片均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;DL2000 DNA Maker、Premix Taq購(gòu)自Takara公司;革蘭氏染色試劑購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2? 樣品采集

根據(jù)牛乳體細(xì)胞數(shù)（Somatic cell count，SCC），每個(gè)月定期采集SCC≤50萬/mL、50萬/mL500萬/mL的奶樣。采樣前先用溫水清洗乳頭及乳房，擦干，消毒，棄掉頭三把奶，用滅菌的50 mL離心管收集奶樣50 mL，做好標(biāo)記，立刻置于冰盒內(nèi)，送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離。

1.3? 病原菌的分離培養(yǎng)

取1 mL奶樣在無菌條件下接種于TSA培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。挑取典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，初步鑒定病原菌特征，然后進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.4? 藥敏試驗(yàn)

利用K-B涂布法測(cè)定分離菌株對(duì)14種常見抗菌藥物的敏感性，藥敏結(jié)果判定依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（NCCLS）。

1.5? 16S rRNA序列鑒定

設(shè)計(jì)合成一對(duì)細(xì)菌16SrRNA基因通用型檢測(cè)引物（F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）。采用菌液PCR對(duì)分離菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系，DNA模板1.0 μL菌液，Premix Taq 10.0 μL，上下游引物各0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至25.0 μL。PCR擴(kuò)增程序，95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后外送測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST序列分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 奶牛樣品體細(xì)胞測(cè)定

每月全群采集奶樣，采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)SCC進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)SCC統(tǒng)計(jì)結(jié)果，抽樣進(jìn)行病原菌的分離與鑒定，奶樣采集情況見表1。

2.2? 病原菌的分離與鑒定

對(duì)分離菌株進(jìn)行16S rRNA通用型引物擴(kuò)增，部分?jǐn)U增結(jié)果見圖1，在大小約1 500 bp處具有特異性擴(kuò)增條帶。通過序列比對(duì)分析，從165份奶樣中分離鑒定出9科16屬235株病原菌。常見的主要致病菌包括葡萄球菌屬的金黃色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌，共分離鑒定出83株，占35.0%;分離鑒定出鏈球菌屬的停乳鏈球菌7株，占2.9%;分離鑒定出埃希氏菌屬的大腸桿菌12株，占5.1%;檢出率比較高的其他病原菌還包括無綠藻屬中型無綠藻，共分離鑒定出36株，占13.5%;分離鑒定出不動(dòng)桿菌屬魯氏不動(dòng)桿菌28株，占11.9%;檢出菌中還包括綠色氣球菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌、費(fèi)氏檸檬酸菌等。鑒定結(jié)果見表2。選取常見致病菌進(jìn)行革蘭氏染色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列成葡萄串狀;停乳鏈球菌呈現(xiàn)革蘭氏陽性球菌，并呈現(xiàn)鏈狀排列;大腸桿菌呈現(xiàn)革蘭氏陰性直桿菌，兩端鈍圓，具體見圖2。

2.3? 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選用牛場(chǎng)常用的林可胺類、酰氨醇類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、和磺胺類等共14種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表3。不同的病原菌對(duì)藥物的敏感性表現(xiàn)出差異。其中氟苯尼考、卡那霉素、慶大霉素、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明對(duì)20種分離菌的敏感率達(dá)到65%以上，敏感率最高的為氟苯尼考，達(dá)到75%。對(duì)分離菌進(jìn)行多重耐藥性分析表明，20株分離菌對(duì)所測(cè)試的14種抗菌藥物均產(chǎn)生不同程度的耐藥性。其中耐藥性最弱的病原菌為綠色氣球菌、假單胞桿菌、棒狀桿菌和微小桿菌，僅對(duì)一種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性;耐藥性最強(qiáng)的病原菌為奇異變形桿菌和中型無綠藻，對(duì)所測(cè)試的14種抗生素均產(chǎn)生耐藥性。

3? 小結(jié)與討論

已發(fā)現(xiàn)的誘發(fā)奶牛乳房炎的病原微生物有150多種，包括細(xì)菌、真菌、酵母菌、藻類和病毒，其中細(xì)菌是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要病原微生物[5]。本研究對(duì)湖北一牛場(chǎng)連續(xù)13個(gè)月每月定期采集的奶樣進(jìn)行病原菌分離、鑒定，觀察病原菌的流行和變化情況，共采集奶樣165份，分離到9科16屬235株病原菌，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，引起牛場(chǎng)奶牛乳房炎的病原菌主要分為3類。一類是傳染性微生物，主要包括金黃色葡萄球菌43株，占分離菌總數(shù)的18.3%;一類是環(huán)境微生物，主要包括大腸桿菌12株，停乳鏈球菌7株，糞腸球菌6株，肺炎克雷伯氏菌2株，奇異變形桿菌6株，費(fèi)氏檸檬酸菌8株，占分離菌總數(shù)的17.4%;一類是其他微生物，主要包括奈瑟氏菌科、芽孢桿菌科、球蓋菇科、放線菌科和綠藻科的病原菌，其中綠藻科的中型無綠藻共分離鑒定出36株，占比15.3%。無綠藻屬于綠球藻，是自然界一種常見的條件致病真菌，1952年被確定為奶牛乳房炎的致病菌，感染后能夠引起奶牛產(chǎn)奶量急劇下降，乳房腫脹，乳汁呈水樣，伴有絮狀沉淀，并且容易成為感染源[7]。由中型無綠藻引起的乳房炎在歐美國(guó)家被廣泛報(bào)告，但是國(guó)內(nèi)鮮有相關(guān)的案例[8]。研究者報(bào)道了北京某牛場(chǎng)由中型無綠藻引起的臨床型乳房炎[9]，從江蘇部分養(yǎng)殖場(chǎng)患乳房炎病的奶樣中分離出4株左氏無綠藻[10]。本研究從患病奶牛奶樣中分離鑒定的病原微生物結(jié)果表明，該牛場(chǎng)奶牛乳房炎致病菌可能由多種細(xì)菌混合感染引起。建議牛場(chǎng)一方面在日常管理方面保持牛舍內(nèi)外環(huán)境衛(wèi)生，勤打掃、勤換墊料，規(guī)范擠奶操作流程，避免在擠奶過程中存在交叉污染[11];另一方面，建立乳房炎早期診斷方法，早發(fā)現(xiàn)早治療，從而減少傳染源[12，13]。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，引起奶牛乳房炎的病原菌對(duì)臨床上常用的抗菌藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌和大腸桿菌是引起該牛場(chǎng)奶牛乳房炎的優(yōu)勢(shì)菌，其中金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素和諾氟沙星產(chǎn)生耐藥，停乳鏈球菌對(duì)所測(cè)試的13種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，大腸桿菌對(duì)林可霉素、青霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明產(chǎn)生耐藥，另外分離到一株中型無綠藻，對(duì)所測(cè)試的14種抗菌藥物均產(chǎn)生耐藥性，這與前人的研究結(jié)果基本一致[9]。由于抗菌藥物的濫用，致使細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)，不僅給治療奶牛乳房炎帶來了障礙，而且嚴(yán)重威脅人類健康。在治療奶牛乳房炎的過程中要貫徹“預(yù)防為主，防治結(jié)合”的方針，除了加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理，還要定期對(duì)奶樣中的病原微生物進(jìn)行耐藥監(jiān)測(cè)，為飼養(yǎng)管理提供切實(shí)可行的用藥方案，切實(shí)保障養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全、動(dòng)物性食品安全和公共衛(wèi)生安全。

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