代新珍，米賢軍，鐘守軍，段立鋒，楊偉洪，劉祥玉，徐秀梅，黃兆華

（中山市博愛醫(yī)院病理科，廣東中山 528403）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有上升并有年輕化的趨勢(shì)，占女性腫瘤死亡原因的第二位。目前研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，其中癌基因的活化、抑癌基因缺乏起主導(dǎo)作用。近年來(lái)隨著對(duì)AP-1 家族成員研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其參與腫瘤的形成、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程，而JunD 作為AP-1 家族成員中重要的一員，很多研究預(yù)測(cè)并提示JunD基因參與腫瘤的增殖、分化與凋亡，并在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中充當(dāng)重要角色［1-2］。然而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于JunD 在乳腺癌組織中的表達(dá)及具體作用的研究鮮有報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法（SP 法）檢測(cè)JunD 在浸潤(rùn)性乳腺癌分子亞型及乳腺良性惡性病變中的表達(dá)情況，分析其差異表達(dá)與臨床的相關(guān)性，期望為浸潤(rùn)性乳腺癌分子亞型的臨床治療及乳腺良惡性病變的鑒別診斷提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

隨機(jī)抽取2013 年7 月至2019 年7 月經(jīng)手術(shù)切除且經(jīng)我科3 位病理醫(yī)生證實(shí)的乳腺增生性病變191 例（乳腺腺病48 例，纖維腺瘤40 例，普通型導(dǎo)管增生30 例，乳頭狀瘤20 例，乳腺不典型增生20 例，導(dǎo)管原位癌33 例），20 例正常乳腺組織作為對(duì)照，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌160 例。其中乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者中位年齡49（28～80）歲；TNM 分期Ⅰ、Ⅱ-Ⅲ期分別有52、108 例；組織學(xué)分級(jí)Ⅰ、Ⅱ-Ⅲ級(jí)分別有17、143 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移98 例；乳腺癌患者中術(shù)后標(biāo)本腫物直徑≤2 cm 的78 例，腫物直徑＞2 cm 的82 例。依據(jù)2013 St Gallen 國(guó)際乳腺癌會(huì)議分子亞型標(biāo)準(zhǔn)共識(shí)［3］，乳腺癌分為L(zhǎng)uminal A 型22 例，Luminal B 型（Her2-）23 例，Luminal B 型（Her2+）69 例，Her2 受體陽(yáng)性型28 例，TNBC 亞型（basallike）18 例。所有乳腺癌患者均是首次住院行腫塊切除術(shù)，未做放療、化療及內(nèi)分泌治療，也未進(jìn)行腋窩淋巴結(jié)活檢手術(shù)以及腋窩的其他手術(shù)，均行乳腺癌改良根治術(shù)或乳腺腫物切除術(shù)，術(shù)前臨床資料完整。所有患者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)本單位倫理委員會(huì)審核同意免倫理審批。

1.2 試 劑

兔單克隆抗體JunD 購(gòu)自abcam 及SP 試劑盒購(gòu)自羅氏公司。

1.3 免疫組織化學(xué)

JunD 抗體工作濃度為1∶300。用PBS 液代替第一抗體作陰性對(duì)照。主要步驟：采用免疫組織化學(xué)SP 法染色，按說(shuō)明書操作。以pH 6.0 的拘緣酸鹽緩沖液微波修復(fù)抗原，滴加1∶300 JunD 單克隆抗體80 μL，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照，試劑盒贈(zèng)送的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，4 ℃過(guò)夜孵育；PBS 洗后，滴加過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育45 min；PBS 洗后，DBA 顯色；蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹脂封片。

1.4 陽(yáng)性結(jié)果判斷

ER、PR、HER2 判定根據(jù)《乳腺癌HER2 檢測(cè)指南（2014 版）》［4］；ER、PR、Ki67 定位于細(xì)胞核，HER2定位于細(xì)胞膜。JunD定位于細(xì)胞核，判斷方法為在鏡下觀察，根據(jù)棕色反應(yīng)的陽(yáng)性強(qiáng)度及面積判斷結(jié)果。采用二級(jí)積分法：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3分，≥75%為4分；染色強(qiáng)度淡黃色為1分，黃或棕黃色為2分，棕黃色為3分；最后計(jì)算兩者得分相乘，閱片采用雙盲法讀片。本標(biāo)本中染色一般為棕黃色，表達(dá)差異主要在于表達(dá)范圍的不同，結(jié)果得分大致分布在0～4 分與9～12 分區(qū)間，故本實(shí)驗(yàn)以兩者得分相乘≥9 分判讀為陽(yáng)性（即表達(dá)范圍大于50%判讀為陽(yáng)性）。閱片采用雙盲法讀片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 19.0完成。兩組樣本間為分類資料，理論數(shù)字均大于5，故均采用四格表非校正卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 JunD 在乳腺組織中的表達(dá)

JunD 在乳腺組織的表達(dá)定位于細(xì)胞核，染色一般為棕黃色，表達(dá)差異主要在于染色范圍的不一致，其在乳腺組織中的代表性染色見（圖1）。160 例浸潤(rùn)性乳腺癌組織中JunD 陽(yáng)性表達(dá)率為45.6%（73/160），20 例乳腺正常組織中JunD 陽(yáng)性表達(dá)率為100%（20/20），48 例乳腺腺病中JunD 陽(yáng)性表達(dá)率87.5%（42/48），30 例乳腺纖維腺瘤中JunD 陽(yáng)性表達(dá)率90.0%（27/30），30 例乳腺普通型導(dǎo)管增生中JunD 陽(yáng)性表達(dá)率90.0%（27/30），20 例JunD 乳腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤中JunD 陽(yáng)性表達(dá)率95.0%（19/20），20 例乳腺導(dǎo)管上皮不典型增生中JunD 陽(yáng)性表達(dá)率90.0%（18/20），33 例乳腺導(dǎo)管原位癌中JunD 陽(yáng)性表達(dá)率87.9%（29/33）。比較不同病理類型中JunD 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，JunD 在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)水平明顯低于正常乳腺組織及乳腺導(dǎo)管上皮增生性病變中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），正常乳腺組織與乳腺導(dǎo)管上皮增生性病變中JunD 表達(dá)均較高，兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；表1）。

圖1 JunD 在不同的乳腺組織中有代表性的染色情況Fig.1 Representative immunohistochemicai staining of JunD in different breast tissues

2.2 JunD 的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

JunD 在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為45.6%（73/160），在組織學(xué)Ⅰ級(jí)與Ⅱ級(jí)+Ⅲ級(jí)之間（陽(yáng)性表達(dá)率分別是82.4%、41.3%，P=0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在患者年齡≤50 歲與＞50歲之間（陽(yáng)性表達(dá)率分別是47.4%、42.9%，P=0.571），在腫瘤直徑≤2 cm 與＞2 cm 之間（陽(yáng)性表達(dá)率分別是44.9%、46.3%，P=0.852），腫瘤TNM 分期中Ⅰ期與Ⅱ+Ⅲ期之間（陽(yáng)性表達(dá)率分別是46.2%、45.4%，P=0.926），在腋窩淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)移之間（陽(yáng)性表達(dá)率分別是51.6%、46.9%，P=0.564），在ER 陽(yáng)性與陰性之間（陽(yáng)性表達(dá)率分別是43.9%、50.0%，P=0.480），在PR 陽(yáng)性與陰性之間（陽(yáng)性表達(dá)率分別是47.4%、42.9%，P=0.571），差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；表1）。

2.3 JunD 在Luminal A 型、Luminal B 型、Her2 受體陽(yáng)性型和TNBC 亞型中的表達(dá)

JunD 在各分子亞型中的表達(dá)情況見（圖2），結(jié)果如下：Luminal A 型陽(yáng)性表達(dá)率為40.9%（9/22），Luminal B 型（Her2-）陽(yáng)性表達(dá)率為30.4%（7/23），Luminal B 型（Her2+）陽(yáng)性表達(dá)率為49.3%（34／69），Her2 受體陽(yáng)性型陽(yáng)性表達(dá)率為32.1%（9/28），TNBC 亞型陽(yáng)性表達(dá)率為77.8%（14/18，表1）。不同分子亞型兩兩相比較發(fā)現(xiàn)，與TNBC亞型相比較，Luminal A 型、Luminal B 型（Her2-）、Luminal B 型（Her2+）、Her2 受體陽(yáng)性型中JunD 的陽(yáng)性表達(dá)明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019，P=0.003，P=0.030，P=0.003），其余各亞型之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；表2）。

表1 JunD 蛋白在不同的乳腺組織中的表達(dá)情況及與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Table 1 The expression of JunD in different breast tissues and its clinical significance

3 討論

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性腫瘤，其發(fā)病的相關(guān)分子機(jī)制尚未明確，其發(fā)生發(fā)展是一系列基因共同協(xié)作的漸進(jìn)性累積過(guò)程。隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，越來(lái)越多的生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，為其預(yù)后判斷、治療方案的選擇提供了更全面的依據(jù)。

圖2 JunD 在浸潤(rùn)性乳腺癌不同分子亞型中有代表性的染色情況Fig.2 Representative immunohistochemical staining of JunD in different subtypes of Invasive ductal carcinoma tissues

表2 JunD 在不同分子亞型乳腺癌組織中的表達(dá)Table 2 The expression of JunD in different subtypes of Invasive ductal carcinoma tissues

JunD 蛋白是由JunD 基因編碼，由347 個(gè)氨基酸組成的分子量約為35 ku 的AP-1 轉(zhuǎn)錄因子。JunD 作為AP-1 家族成員中重要的一員，JunD 參與腫瘤的增殖、凋亡及分化，在腫瘤的形成過(guò)程中起著重要作用［5］。國(guó)外研究［6-8］發(fā)現(xiàn)在T 細(xì)胞淋巴瘤、B 細(xì)胞淋巴瘤及惡性膠質(zhì)瘤的癌細(xì)胞中，JunD的蛋白呈現(xiàn)出異常表達(dá)；在人類口腔癌、前列腺癌及胃腸道腫瘤中，JunD 均有其相關(guān)的基因作用機(jī)制調(diào)控腫瘤的進(jìn)展［9-11］。以上文獻(xiàn)顯示JunD 通過(guò)各種調(diào)控機(jī)制在各種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，然而對(duì)于JunD 在乳腺癌中的研究鮮少見。本研究發(fā)現(xiàn)JunD 在浸潤(rùn)性乳腺癌中表達(dá)水平明顯低于乳腺正常組織及乳腺增生性病變中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示JunD 有助于維持乳腺組織正常生長(zhǎng)，JunD 表達(dá)缺失促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。Toullec［12］等研究提示JunD 的表達(dá)缺失激活了腫瘤反應(yīng)基質(zhì)，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生，JunD 在乳腺癌中低表達(dá)，本研究結(jié)果與Toullec 是一致的。JunD 蛋白協(xié)調(diào)細(xì)胞正常增殖、分化及轉(zhuǎn)化等過(guò)程，下調(diào)JunD 會(huì)影響細(xì)胞的正常成熟和分化，促進(jìn)細(xì)胞增殖；JunD 能夠阻遏Ras 介導(dǎo)的癌化過(guò)程，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，激活細(xì)胞分化［13-15］。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)JunD 在浸潤(rùn)性乳腺癌組織學(xué)Ⅰ級(jí)（高分化）中的陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于組織學(xué)Ⅱ級(jí)-Ⅲ級(jí)組（中-低分化），表明了JunD的表達(dá)與腫瘤惡性程度有關(guān)，隨著惡性等級(jí)增高，其陽(yáng)性率逐漸降低，JunD 高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞分化往往較好，JunD 在乳腺癌中是預(yù)后較好的指標(biāo)，與上述文獻(xiàn)預(yù)測(cè)一致。本研究其他結(jié)果發(fā)現(xiàn)JunD在乳腺癌中的表達(dá)與腫物直徑大小、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR 及臨床分期無(wú)關(guān)（P＞0.05），結(jié)果與目前文獻(xiàn)報(bào)道有一點(diǎn)差異。Chen 等［16］發(fā)現(xiàn)在體外人類乳腺癌細(xì)胞株中，JunD 蛋白與JunB蛋白協(xié)同作用，選擇性降低芳香化酶的活性，抑制雌激素的合成，而本研究發(fā)現(xiàn)JunD 的表達(dá)與ER、PR 的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)；Detry 等［17］發(fā)現(xiàn)在人類乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 中，JunD 蛋白能識(shí)別并結(jié)合BSP 啟動(dòng)子的cAMP 應(yīng)答原件（cAMPresponse element，CRE），過(guò)表達(dá)JunD 增強(qiáng)BSP 啟動(dòng)子活性，上調(diào)BSP 的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生及骨轉(zhuǎn)移，而本研究結(jié)果提示JunD 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。這些差異可能與JunD 一大特點(diǎn)有關(guān)即為在所有的細(xì)胞類型中JunD 都是組成性表達(dá)，上述研究都是在體外細(xì)胞系中JunD 對(duì)細(xì)胞遷移及雌激素的影響，而在乳腺癌患者復(fù)雜體系中可能存在其他JunD 相關(guān)基因組成性表達(dá)，例如通過(guò)激活乳腺癌標(biāo)志物L(fēng)Y6K 的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移，降低生存率［2］，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)果有一些差異，JunD 在浸潤(rùn)性乳腺癌中的這些具體相關(guān)機(jī)制有待后期進(jìn)一步研究。

JunD 在浸潤(rùn)性乳腺癌分子亞型的中的表達(dá)情況及相關(guān)作用，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少見。Wayne 等［18］發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)性乳腺癌TNBC 亞型/basallike 中總是會(huì)出現(xiàn)JunD 高表達(dá)，JunD 在TNBC 亞型中可能起著重要作用。有研究者［19-20］發(fā)現(xiàn)50%浸潤(rùn)性乳腺癌TNBC 亞型存在各種各樣的角蛋白的高表達(dá)，JunD 存在其中一種角蛋白KRT5 的結(jié)合位點(diǎn)，他們常常組成性高表達(dá)，JunD 的高表達(dá)激活了TNBC 亞型中TGFBR3-JUND-KRT5 信號(hào)通路等，JunD 在TNBC 亞型中充當(dāng)重要角色。本研究也發(fā)現(xiàn)JunD 在TNBC 亞型陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)77.8%，而在Luminal A 型為40.9%，Luminal B 型（Her2-）為30.4%，Luminal B 型（Her2+）陽(yáng)性表達(dá)率為49.3%，Her2 受體陽(yáng)性型為32.1%。兩兩比較，TNBC 亞型表達(dá)水平明顯高于Luminal A 型、Luminal B 型（Her2-）、Luminal B 型（Her2+）、Her2受體陽(yáng)性型中的表達(dá)，相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各亞型之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這與上述文獻(xiàn)的研究結(jié)果是一致。2013 年St Gallen［3］國(guó)際乳腺癌會(huì)議共識(shí)將 乳腺癌 分為5 型：Luminal A 型，Luminal B 型（Her2-），Luminal B 型（Her2+），Her2 受體陽(yáng)性型，TNBC 亞型（basal-like），該分類方法更精確的反應(yīng)乳腺癌的生物學(xué)行為，提高了預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性，有利于個(gè)體化治療。Luminal A 型及Luminal B型可以化療和內(nèi)分泌治療，預(yù)后較好；Her2 受體陽(yáng)性型目前可以分子靶向治療；而TNBC 亞型惡性程度高，容易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移早，內(nèi)分泌治療效果差，缺乏有效的分子靶向治療，預(yù)后很差。湯謐等［21］研究提出Runx2 樹突狀細(xì)胞基因疫苗可能可以特異性殺傷TNBC 亞型細(xì)胞，對(duì)其個(gè)性化治療中起到一定的作用，但目前對(duì)于這種的靶向治療尚不完善，缺乏有效可行的方法。所以我們認(rèn)為，對(duì)于目前相對(duì)缺乏治療方法的浸潤(rùn)性乳腺癌TNBC亞型來(lái)說(shuō)，JunD在其中的高表達(dá)為靶向治療提供了一定的研究方向，深入研究JunD 在TNBC亞型中的作用機(jī)制，有可能為浸潤(rùn)性乳腺癌TNBC亞型的個(gè)性化靶向治療提供一定的幫助。

綜上所述，JunD 在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為45.6%，明顯低于乳腺增生組織及正常乳腺組織，聯(lián)合檢測(cè)JunD 在乳腺組織中的表達(dá)情況，有利于乳腺良惡性病變的鑒別診斷。JunD 在浸潤(rùn)性乳腺癌TNBC 亞型中顯著高表達(dá)，有望為TBNC 亞型乳腺癌患者個(gè)性化靶向治療研究提供一定方向，但其相關(guān)分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

衷心感謝陳昂副主任醫(yī)師幫忙審核統(tǒng)計(jì)方法；衷心感謝陳志強(qiáng)副主任技師指導(dǎo)切片及染色。