丁繼東，許文強，劉曉蕾，鄒明新，時靜華，邵 國

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院；3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院)

1,10-鄰菲啰啉[phen]是一種有機配體，與過氧化釩進行配位形成1,10鄰二氮雜菲雙過氧釩酸鉀(bpV[phen])，具有治療糖尿病和癌癥等生物學(xué)功能[1]。pV[phen]是一種磷酸化酶抑制劑，可以影響眾多細胞生理過程。bpV[phen]能增強神經(jīng)營養(yǎng)因子活性，從而改善神經(jīng)元的生存，研究發(fā)現(xiàn)注射bpV[phen]可減輕6-OH DA對大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷[2]。

本課題組前期研究顯示，bpV[phen]可以增加小鼠海馬神經(jīng)元細胞HT22中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)的表達[3]，而DNMT3B在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用[4]。有報道bpV[phen]可以通過影響神經(jīng)元的凋亡從而影響動物學(xué)習(xí)記憶的能力[5-6]。本研究通過側(cè)腦室注射，研究bpV[phen]對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力(水迷宮)，傷害刺激回避反應(yīng)能力(跳臺實驗)，條件主動回避能力(穿梭實驗)和被動回避能力(避暗實驗)的影響，探究bpV[phen]對小鼠不同行為能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雄性ICR小鼠80只(6～8周)，18 g～22 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。

1.1.2試劑和設(shè)備 大腦立體定位儀和電動顱骨鉆(瑞沃德生命科技有限公司)；ZS-OO1 Morris水迷宮分析系統(tǒng)、SDT-8跳臺實驗系統(tǒng)、STT-100穿梭實驗系統(tǒng)、PAT-8避暗視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；手術(shù)器材和麻醉劑等其他設(shè)備和耗材均由包頭醫(yī)學(xué)院中心實驗室提供。

1.2方法

1.2.1側(cè)腦室藥物注射 將小鼠隨機分為PBS組和bpV[phen]組兩組(40只/組)，分別進行側(cè)腦室藥物注射。bpV[phen]組緩慢注射5 μL的0.1 mg/mL的bpV[phen]溶液，PBS組注射等體積1 mol/L的PBS。

1.2.2行為學(xué)實驗 將不同藥物組小鼠再隨機分為4組(n=10)，分別進行Morris水迷宮實驗、跳臺實驗、穿梭實驗和避暗實驗。(1)Morris水迷宮實。水迷宮實驗按文獻方法進行[7]，連續(xù)學(xué)習(xí)4 d(定位航行實驗)，記錄小鼠尋找平臺的潛伏期；隔天撤去平臺進行最后的測試(空間探索實驗)，記錄小鼠90 s內(nèi)目標象限穿越次數(shù)，計算目標象限內(nèi)時間和路程占總時間和總路程的百分比。(2)跳臺實驗。將小鼠從跳臺上放入實驗箱中，自由活動2 min以適應(yīng)環(huán)境。然后通過箱底部銅柵板給予電刺激(電擊強度為36 V，50 Hz)，小鼠正常反應(yīng)是跳回平臺。多數(shù)小鼠會再次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺(記犯錯1次)。每只小鼠訓(xùn)練5 min，記錄犯錯次數(shù)。24 h后重做試驗，記錄小鼠第1次跳下平臺時間(潛伏期)和犯錯次數(shù)。(3)穿梭實驗。本實驗進行3 d，第1 d為適應(yīng)階段，設(shè)置10次循環(huán)，第2 d為學(xué)習(xí)訓(xùn)練，第3 d為記憶測試，后兩天都設(shè)置40次循環(huán)。將小鼠背對洞口置于1室，開始實驗，系統(tǒng)通過紅外線監(jiān)測小鼠所在反應(yīng)室，給予條件刺激燈光20 s，后10 s內(nèi)同時給以電刺激(36 V，50 Hz)。如果在亮燈10 s內(nèi)小鼠逃向安全區(qū)為主動回避反應(yīng)(active avoidance response，AAR)，電擊后才逃向安全區(qū)為被動回避反應(yīng)(passive avoidance response，PAR)。在AAR和PAR刺激的過程中仍然停留在同側(cè)箱中，則為逃避失敗(escape failure，EF)。記錄后兩天小鼠的AAR次數(shù)、PAR次數(shù)、錯誤反應(yīng)次數(shù)及主動回避反應(yīng)潛伏期(Latency of active avoidance response，LAAR)。以AAR次數(shù)作為其學(xué)習(xí)記憶成績的主要評價指標，并計算條件反應(yīng)潛伏期平均時間。(4)避暗實驗。實驗分訓(xùn)練和測試兩天。第1 d：訓(xùn)練前不通電，先讓小鼠在明室和暗室之間自由穿梭，適應(yīng)3 min以消除探究反射，一般小鼠會全部待在暗室；然后開始訓(xùn)練，關(guān)閉洞口，將小鼠重新放回明室，開始實驗同時打開洞口，系統(tǒng)開始計時，當小鼠第一次全身進入暗室，計時停止，此即為步入潛伏期(step through latency,STL)，受電擊(36 V，50 Hz)后逃出暗室(計犯錯1次)，大多數(shù)小鼠會休息片刻后重新返回暗室，訓(xùn)練時間設(shè)為5 min，記錄錯誤次數(shù)(error times，ETs)。訓(xùn)練時步入潛伏期大于3 min者棄用。訓(xùn)練完成24 h后將小鼠再次放入明室，記錄其第一次進入暗室所需的時間，即步入潛伏期和5 min內(nèi)錯誤次數(shù)。若5 min內(nèi)小鼠未進入暗室則STL記為300 s，ETs記為0。

2 結(jié)果

2.1Morris水迷宮(測試空間學(xué)習(xí)記憶能力) 定位航行實驗中，PBS組從第1 d(D1)到第4 d(D4)潛伏期呈變短趨勢，提示小鼠學(xué)習(xí)了尋找平臺的任務(wù)，而bpV[phen]組潛伏期則未呈遞減趨勢，D2、D3變短而第D4又變長，提示可能由于藥物代謝，對學(xué)習(xí)記憶的影響降低；D2的bpV[phen]組潛伏期比PBS組短(P<0.05)，見圖1-A。

空間探索實驗中，與PBS組相比，bpV[phen]組小鼠目標象限穿越次數(shù)較多(P<0.05)；目標象限停留時間和行進路程百分比兩項，兩組之間比較無明顯差異(P>0.05)，見圖1-B。

圖1 bpV[phen]對空間小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(*：P<0.05)

2.2跳臺實驗(測試對傷害性刺激的反應(yīng)能力) 藥物注射后，兩組小鼠在D1時犯錯次數(shù)無明顯差異(P>0.05)；在D2時兩組小鼠犯錯次數(shù)較D1時均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但兩組間比較無明顯差異(P>0.05)；在D3時而bpV[phen]組小鼠犯錯次數(shù)高于PBS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) 。見圖2。

各組小鼠在D1時由于第1次受電擊，潛伏期普遍較短，但D2時潛伏期明顯延長(P<0.05)，D3時繼續(xù)延長(P>0.05)。將D3時潛伏期作為小鼠記憶能力測試指標，bpV[phen]組小鼠潛伏期明顯短于PBS組(P<0.05)。見表1。

圖2 bpV對小鼠跳臺錯誤次數(shù)的影響

表1 bpV對小鼠跳臺潛伏期的影響(s)

a為與同組D1時比較，P<0.05；b為與同組D2時比較，P<0.05；c為與D3時PBS組比較，P<0.05

2.3穿梭實驗(檢測對主動回避能力的影響) 手術(shù)后24 h學(xué)習(xí)訓(xùn)練階段，與PBS組相比，bpV[phen]組小鼠的犯錯次數(shù)(EFs)明顯少于PBS組(P<0.05)；其余各項兩組間比較無明顯差異(P>0.05)。見表2。

手術(shù)后48 h記憶測試階段，PBS組和bpV[phen]組的PARs較學(xué)習(xí)訓(xùn)練階段都下降(P<0.05)、兩組AARs均上升(P<0.05)；兩組EFs均明顯降低(P<0.05)，且PBS組的EFs減少更明顯(P<0.05)。見表2。

表2 bpV[phen]對小鼠穿梭實驗的影響

a為在學(xué)習(xí)訓(xùn)練階段與PBS組相比，P<0.05；b為與同組學(xué)習(xí)訓(xùn)練階段相比，P<0.05；c為在記憶測試階段與PBS組相比，P<0.05

2.4避暗實驗(檢測對被動回避能力的影響) 避暗實驗3 d內(nèi)每組的犯錯次數(shù)呈減少趨勢，提示小鼠完成了學(xué)習(xí)任務(wù)。D1時由于小鼠未經(jīng)電擊，在明室強光照射下很快進入暗室(潛伏期普遍極短)，當足部受到電擊后返回明室；D3時潛伏期基本上達到設(shè)定的實驗時間300 s，只有bpV[phen]組有個別小鼠進入暗室犯錯，PBS組小鼠均待在明室，犯錯次數(shù)為0。每天兩組間組犯錯次數(shù)比較，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見圖3。

圖3 pV[phen]對小鼠避暗實驗的影響

3 討論

目前較常用的評價小鼠記憶能力的實驗方法有Morris水迷宮實驗、跳臺實驗、穿梭實驗和避暗實驗[8]。Morris水迷宮用于空間記憶功能評估[9]，跳臺系統(tǒng)用于測試小鼠對傷害性刺激的記憶[10]，穿梭系統(tǒng)檢測小鼠的條件主動學(xué)習(xí)記憶能力[11]，避暗實驗檢測的是小鼠對傷害性刺激的被動學(xué)習(xí)能力[12]。

有研究顯示，表觀遺傳學(xué)在大腦中的海馬組織參與信息貯存、學(xué)習(xí)記憶等重要功能，通過表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的基因表達的開啟或關(guān)閉、增強或減弱，最終參與學(xué)習(xí)記憶的形成[13]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，大腦中學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的甲基化和去甲基化的變化可能在學(xué)習(xí)，記憶形成和行為可塑性方面發(fā)揮重要作用[14]。DNA甲基化由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)調(diào)節(jié)，到目前為止，共有三種有甲基轉(zhuǎn)移酶活力的DNMT被發(fā)現(xiàn)。本課題組前期研究顯示，bpV[phen]可以增加小鼠海馬神經(jīng)元細胞HT22中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)的表達[3]，因此bpV[phen]處理影響小鼠行為學(xué)可能與其對DNMT3B的影響有關(guān)。

不同的釩化物對行為學(xué)的影響可能有所差異。通過飲水使大鼠攝入釩化物后可以使釩化物在大鼠紋狀體積累，增加紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)Ach、5-HT和GABA的水平并影響其相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶[15]。而V2O5通過影響海馬CA1腦區(qū)來損害了空間學(xué)習(xí)記憶[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)bpV[phen]對空間學(xué)習(xí)記憶(水迷宮實驗)，害傷性刺激(跳臺實驗)以及條件主動學(xué)習(xí)記憶(穿梭實驗)均有影響，而對被動學(xué)習(xí)記憶測試(避暗實驗)未見影響，提示bpV[phen]側(cè)腦室注射對小鼠不同的行為有不同的影響。進一步明確其機制需從bpV[phen]在不同腦區(qū)的作用差異做進一步的研究。