摘 要：

殺菌劑的生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)主要包括病原菌的采集、分離與提純、離體培養(yǎng)及殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定。生長(zhǎng)速率法、抑菌圈法、孢子萌發(fā)法等均是常用的殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定方法。本文概述了我國部分重要的果蔬采后病害的生物測(cè)定方法，并對(duì)未來果蔬采后病害的綜合防治方法做出展望。

關(guān)鍵詞：

果蔬;殺菌劑;采后病害;室內(nèi)毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)：S482.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191130015

1 果樹及蔬菜病原菌的采集、分離與純化以及離體培養(yǎng)

1.1 病原物的采集

在筆者所查閱的文獻(xiàn)中，研究人員采集果樹及蔬菜病原菌的方法可大致分為從田間病樣中采集培養(yǎng)和直接使用高校或科研院所保藏的菌株2類。從田間收集病樣后，組織分離法是較為常見的采集方法。以西北地區(qū)常見的蘋果腐爛病病菌（Cytospora spp.）為例，臧睿[1]等從陜西省不同的蘋果產(chǎn)區(qū)，收集有蘋果腐爛病的病枝，按常規(guī)組織塊分離法采集病原菌，將各分離病原菌株接種離體枝條再從病部挑取繁殖體在PDA培養(yǎng)基上來純培養(yǎng)病原菌?；菽饶萚2]等在研究蘋果腐爛病菌時(shí)，從當(dāng)?shù)靥O果園的病樣上用組織分離法來采集病原菌，并進(jìn)一步挑取菌落邊緣的菌絲來進(jìn)行分離純化。該文獻(xiàn)中對(duì)組織分離法有著詳細(xì)的描述，組織分離法大致可分為從病健交界處切下小塊，3%次氯酸鈉溶液中消毒，70%酒精消毒，無菌水清洗，無菌濾紙自然晾干，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5步。對(duì)于一些常用的菌株，一些科研機(jī)構(gòu)一般會(huì)有所保藏，這樣，科研工作者在研究時(shí)可以直接活化菌株后使用，省時(shí)省力，而且所用病原菌的純度較高，可以節(jié)省后續(xù)分離純化的步驟。王帥等在研究蘋果腐爛病菌時(shí)，直接利用西北農(nóng)林科技大學(xué)提供的蘋果腐爛病菌菌株進(jìn)行研究。

1.2 病原物的分離純化

在筆者所查閱的文獻(xiàn)中，平板劃線法和稀釋涂布法是較為常用的分離純化方法，這2種方法中，又以平板劃線法使用較多。以新疆地區(qū)的厚皮甜瓜采后病害為例，陳存坤等、毛曉英等、吳倩等在各自的研究中，均采用組織分離法采集病原菌，并進(jìn)一步用平板劃線法或稀釋涂布法分離純化。

1.3 病原物的離體培養(yǎng)

對(duì)于病原菌的離體培養(yǎng)，要根據(jù)所研究病原菌的生物學(xué)特性選用合適的培養(yǎng)基，常用的培養(yǎng)基有PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基等。

2 殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定方法的研究

殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定方法主要有生長(zhǎng)速率法、抑菌圈法、孢子萌發(fā)法。在筆者所查閱的文獻(xiàn)中，生長(zhǎng)速率法、孢子萌發(fā)法是最為常用的殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定方法。其中，生長(zhǎng)速率法與抑菌圈法側(cè)重于研究殺菌劑對(duì)病原菌菌絲體生長(zhǎng)的抑制作用，孢子萌發(fā)法側(cè)重于研究殺菌劑對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用。生長(zhǎng)速率法較抑菌圈法操作步驟少，故應(yīng)用較多。

2.1 生長(zhǎng)速率法

在筆者所查閱的文獻(xiàn)當(dāng)中，應(yīng)用生長(zhǎng)速率法的有5篇，涉及草莓灰霉病、洋蔥黑霉及基腐病、西瓜枯萎病和番茄的某類采后病害。生長(zhǎng)速率法的一般操作為用一定孔徑的打孔器從活化的病原菌菌落邊緣上打取菌塊，分別接種到含或不含殺菌劑的平板中，培養(yǎng)一段時(shí)間后用十字交叉法垂直測(cè)量菌落直徑并比較，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

草莓是我國重要的經(jīng)濟(jì)性水果，草莓灰霉病是草莓生產(chǎn)上重要的采后病害，其病原物為灰葡萄孢（Botrytis cinerea），楊敬輝等采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了50%啶酰菌胺對(duì)草莓灰霉病菌的毒力，待對(duì)照中菌落快長(zhǎng)滿平皿時(shí)，采用十字交叉法量取菌落直徑，并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)平均抑制率。Joon-Oh Kim等人測(cè)定了咯菌腈、異菌脲、嘧霉胺、戊唑醇、苯吡唑胺、啶酰菌胺對(duì)灰葡萄孢的防治效果。在生長(zhǎng)速率測(cè)定法中通過測(cè)量菌絲體在添加了殺菌劑與未添加殺菌劑的培養(yǎng)基中菌絲體的線性生長(zhǎng)量，通過將添加了殺菌劑的PDA線性生長(zhǎng)速率與未添加殺菌劑的PDA線性生長(zhǎng)速率進(jìn)行比較來確定生長(zhǎng)抑制率。

洋蔥的黑霉病由Aspergillus niger引起，基腐病由Fusarium oxysporum f.sp. cepae引起，這2種病害是在洋蔥的儲(chǔ)藏期造成巨大損失的病害，A.S. Futane等人利用生長(zhǎng)速率測(cè)定法測(cè)定了10種殺菌劑對(duì)2種病原物菌絲體生長(zhǎng)的抑制作用，并計(jì)算菌絲體生長(zhǎng)的抑制百分比，進(jìn)而找到對(duì)洋蔥黑霉病、基腐病防治效果較好的殺菌劑。

Mark等人利用生長(zhǎng)速率法測(cè)定二氧化氯氣體熏蒸對(duì)Alternaria alternate、Stemphylium vesicarium的防治效果。Mark等所使用的是氣體熏蒸作用的殺菌劑ClO2，首先氣體熏蒸處理一段時(shí)間，后續(xù)操作同上。

許彥等采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定幾種殺菌劑對(duì)西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. niveum）的室內(nèi)毒力，所采用的生長(zhǎng)速率法與上述相似。

2.2 抑菌圈法

在筆者所查閱的文獻(xiàn)當(dāng)中，應(yīng)用抑菌圈法的較少，只有1篇。細(xì)交鏈孢菌（Alternaria alternata ）可引起梨黑斑病、草莓黑斑病等多種病害。崔娜等選取市面上常見的18種殺菌劑采用抑菌圈法對(duì)細(xì)交鏈孢菌進(jìn)行室內(nèi)抑菌效果測(cè)定。配制好分生孢子懸浮液，在培養(yǎng)皿中倒入純瓊脂培養(yǎng)基，冷凝后插入牛津杯。將配置好的分生孢子懸浮液與PDA培養(yǎng)基按一定的比例混合，取部分培養(yǎng)基倒入純瓊脂培養(yǎng)基上方制成平板，待培養(yǎng)基冷凝后拔出牛津杯，形成一個(gè)小圓孔，然后在小圓孔內(nèi)加入殺菌劑，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈邊緣至小圓孔邊緣的距離 （抑菌距離），用以評(píng)價(jià)供試菌對(duì)不同藥劑的敏感性。

2.3 孢子萌發(fā)法

在筆者所查閱的文獻(xiàn)當(dāng)中，應(yīng)用孢子萌發(fā)法的有5篇。在所查閱的文獻(xiàn)中，孢子萌發(fā)法的基本操作相同，但在某些操作中又有區(qū)別，有的采用玻片法，有的采用懸滴法。

王帥等在研究生物源殺菌劑對(duì)蘋果樹腐爛病菌的室內(nèi)活性評(píng)價(jià)時(shí)，測(cè)定了10種生物源殺菌劑對(duì)Valsa mali分生孢子萌發(fā)的抑制效果。操作可分為分生孢子懸浮液配制和玻片法2步。將殺菌劑與PDA培養(yǎng)基混勻，制成含藥培養(yǎng)基，切取1cm2左右的含藥培養(yǎng)基放置于載玻片上，滴入配制好的分生孢子懸浮液，涂抹均勻，培養(yǎng)一段時(shí)間后在普通光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)分生孢子的萌發(fā)情況并計(jì)算萌發(fā)抑制率。

Joon-Oh Kim等人采用室內(nèi)毒力測(cè)定方法較為全面，包含生長(zhǎng)速率法、孢子萌發(fā)法和殺菌劑對(duì)產(chǎn)孢抑制的作用3個(gè)方面。生長(zhǎng)速率法在前面已講，此處不再贅述。采用孢子萌發(fā)法做室內(nèi)毒力測(cè)定，實(shí)驗(yàn)步驟與王帥等的相同，通過比較菌株在對(duì)照培養(yǎng)基和添加有殺菌劑的培養(yǎng)基上的分生孢子產(chǎn)生數(shù)量來測(cè)算產(chǎn)孢抑制率。

黃海等在進(jìn)行番茄灰霉病菌室內(nèi)毒力測(cè)定及藥效試驗(yàn)時(shí)采用了孢子萌發(fā)法測(cè)定40%多菌靈（WP）、50%異菌脲（WP）和40%嘧霉胺（WP）對(duì)番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用。其使用的方法與王帥等的略有不同，其使用無菌水來溶解藥液，并使孢子懸浮液與不同濃度的藥液混合，在吸取部分混合液滴到凹玻片上，測(cè)算孢子萌發(fā)抑制率。

趙新海等在研究康地蕾得對(duì)黃瓜枯萎病的室內(nèi)生物活性測(cè)定時(shí)，采用孢子萌發(fā)法進(jìn)行了康地蕾得對(duì)黃瓜枯萎病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定。實(shí)驗(yàn)主要包括孢子懸浮液配制與懸滴法測(cè)定孢子萌發(fā)率2步，但文獻(xiàn)中并未對(duì)懸滴法做出比較詳細(xì)的解釋。

蘋果黑星病的病原物為Venturia inaequalis，Umit Arslan研究硼酸、磷酸二氫鉀、焦亞硫酸鈉控制蘋果黑星病的效用，采用孢子萌發(fā)法測(cè)試以上物質(zhì)及戊唑醇與氟吡菌酰胺的混合藥液的殺菌毒力，將孢子懸浮液加入到有土豆葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）組織培養(yǎng)平板孔中，在培養(yǎng)基中分別添加上述殺菌物質(zhì)，之后取試樣在顯微鏡下培養(yǎng)觀察，并統(tǒng)計(jì)孢子的萌發(fā)率。

3 展望

由于采后農(nóng)產(chǎn)品的生理和生化變化，在收獲后和儲(chǔ)存期間新鮮農(nóng)產(chǎn)品對(duì)采后疾病的敏感性增加，這有利于采后病原物的生長(zhǎng)發(fā)展和采后疾病的發(fā)生，也是通過供應(yīng)鏈造成損失的主要原因。目前，化學(xué)殺菌劑仍然是防治果蔬采后病害的有效手段。但是，病原物的抗藥性和殺菌劑的殘留問題正在促使研究者不斷探索其他防治方法。本研究能為果蔬采后病害化學(xué)殺菌劑的合理使用打下牢固的基礎(chǔ)，對(duì)果蔬采后病害的綜合治理也具有借鑒意義。在未來的采后病害防治中，化學(xué)防治、生物防治、物理防治技術(shù)的探索以及綜合使用將會(huì)不斷發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

[1]臧睿，黃麗麗，康振生，王旭麗.陜西蘋果樹腐爛病菌（Cytospora spp.）不同分離株的生物學(xué)特性與致病性研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2007（04）：343-351.

[2]惠娜娜，郭建明，李繼平，張大為，王立，鄭果.6種殺菌劑對(duì)蘋果樹腐爛病菌的毒力測(cè)定及田間防治效果[J].中國果樹，2018（06）：54-56.

作者簡(jiǎn)介：

張俊有（1968-），男，農(nóng)藝師。研究方向：果樹栽培、病蟲防治、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。