王林輝， 張雄， 陳慧勇， 杜日昌， 高雙全， 張瑩， 譚彩云

粵北人民醫(yī)院 1病理科， 3胸外科(廣東韶關(guān) 512026)； 2重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究中心(重慶 400016)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)是肺癌最為常見(jiàn)的病理類(lèi)型，由于NSCLC缺乏有效的早期診斷標(biāo)記物，加之其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移早，病死率居高不下，因而研究在肺癌形成和發(fā)展過(guò)程中關(guān)鍵基因并尋找針對(duì)這些基因的藥物可能對(duì)治療NSCLC具有重要意義。整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過(guò)調(diào)節(jié)整合素以及整合素所介導(dǎo)的一些重要靶蛋白[1]或關(guān)鍵信號(hào)通路[2-3]，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等過(guò)程[4-5]。在肺癌中，ILK也發(fā)揮重要作用。Abd EI-Rehim等[6]對(duì)97例NSCLC患者的癌組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，46.4%的病例存在ILK過(guò)度表達(dá)，且ILK的表達(dá)與NSCLC的病理分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。姜黃素是一種具有多種生物學(xué)活性的天然多酚類(lèi)化合物，如抗炎[7]、抗氧化[8]、抗腫瘤[9]、防治神經(jīng)變性疾病[10]等。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)肺癌也具有顯著的抗癌效果[11-12]，但姜黃素是否可通過(guò)調(diào)節(jié)ILK的表達(dá)而發(fā)揮其抗癌效應(yīng)卻未見(jiàn)報(bào)道。因此，2018年11月至2019年6月，本研究以人肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖的影響并探討其作用機(jī)制，為姜黃素防治肺癌的臨床應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549購(gòu)自中科院昆明細(xì)胞庫(kù)(KCB200434YJ)。

1.2 主要試劑 姜黃素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、0.1%的胰蛋白酶消化液、青/鏈霉素、LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Life公司、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測(cè)試劑盒、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、qRT-PCR試劑盒、蛋白提取試劑盒、蛋白濃度檢測(cè)試劑盒和SDS-Page膠配置試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人ILK、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司；內(nèi)參抗體β-actin以及山羊抗兔的HRP-IgG二抗購(gòu)自北京博鰲森生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

1.3 藥物配置 稱(chēng)取100 mg姜黃素，完全溶于DMSO中，加入三蒸水使其終濃度為1.0 mmol/L，過(guò)濾后置-20℃保存。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的人NSCLC細(xì)胞A549放入37℃恒溫水浴鍋中復(fù)蘇，移入培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549細(xì)胞充分吹打混勻制成單細(xì)胞懸液，按濃度為每孔1×105個(gè)接種于96孔板中；24 h后，待細(xì)胞充分貼壁后，加入5、10、20、40 μmol/L不同濃度的姜黃素，作用不同的時(shí)間(24、48、72 h)；并設(shè)置空白對(duì)照組和溶劑DMSO對(duì)照組，且每組設(shè)置復(fù)孔4個(gè)。在不同時(shí)間點(diǎn)，加入5 mg/mL的MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入150 μL/孔的DMSO液終止培養(yǎng)。充分振蕩混勻后，采用酶標(biāo)儀讀取A490nm。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-試驗(yàn)組A490/空白對(duì)照組A490。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至90%后開(kāi)始轉(zhuǎn)染。首先準(zhǔn)備2個(gè)EP管，取出一個(gè)加入0.75 mL的無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)基，并往其中加入8 μg的質(zhì)粒pcDNA3.1或pcDNA3.1-ILK(由上海吉?jiǎng)P基因設(shè)計(jì)并合成)，充分混勻；另一個(gè)EP管加入0.75 mL無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)液，并加入30 μL的 LipofectamineTM2000；將2個(gè)EP管內(nèi)的液體充分混勻后靜止20 min，然后加入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)6 h；棄培養(yǎng)液并更換正常的培養(yǎng)液(含血清和抗生素)，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 Realtime-PCR 收集各組細(xì)胞，并根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明提取各組細(xì)胞的總RNA，并測(cè)定RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒操作合成cDNA，然后再按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)ILK、β-catenin和VEGF的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.8 Western blot 收集各組細(xì)胞，加入100 μL蛋白裂解液，冰上孵育20 min，離心后收集上清。采用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。將20 μL蛋白樣品上樣后，SDS-PAGE膠電泳分離后，切膠、轉(zhuǎn)膜，并用含0.5 g/L脫脂奶粉TBST液室溫封閉1 h，加入抗體ILK(1∶200)、anti-β-catenin(1∶200)、anti-VEGF(1∶200)和β-actin抗體(1∶5 000)，4℃孵育過(guò)夜；用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h，ECL法顯影，并用凝膠化學(xué)成像分析儀記錄其OD值。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 與空白對(duì)照組比較，A549細(xì)胞的增殖抑制率在DMSO對(duì)照組和5 μmol/L的姜黃素處理24 h時(shí)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)姜黃素濃度增加至10、20和40 μmol/L作用24 h后，細(xì)胞的增殖抑制率明顯增加(P<0.01)，且隨著濃度的增加而更加明顯(P<0.01)。結(jié)果還顯示，當(dāng)姜黃素濃度為5 μmol/L作用A549細(xì)胞48和72 h后，此時(shí)姜黃素對(duì)癌細(xì)胞的抑制率與作用24 h的抑制率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)姜黃素濃度增加到10、20、40 μmol/L后，作用48和72 h時(shí)的抑制率與作用該細(xì)胞24 h時(shí)比較，有顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1、表1。

*與空白對(duì)照組比較P<0.01； #與處理24 h比較P<0.01

項(xiàng)目24 h48 h72 h空白對(duì)照組0.7±0.11.3±0.21.4±0.2DMSO對(duì)照組1.2±0.12.1±0.22.4±0.2姜黃素5 μmol/L組2.4±0.22.8±0.53.1±0.4姜黃素10 μmol/L組12.9±2.3?24.3±3.8?41.7±4.9?姜黃素20 μmol/L組22.9±4.1?△38.4±7.2?△45.7±6.5?△姜黃素40 μmol/L組39.8±3.5?△49.6±7.4?△62.1±4.8?△

*與空白對(duì)照組比較P<0.01; △與姜黃素10 μmol/L組比較P<0.01

2.2 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)ILK、β-catenin和VEGF基因和蛋白表達(dá)水平的影響 與空白對(duì)照組比較，DMSO對(duì)照組和5 μmol/L姜黃素處理24 h時(shí)A549細(xì)胞內(nèi)的ILK、β-catenin和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而當(dāng)姜黃素增至20 μmol/L后，細(xì)胞內(nèi)的ILK、β-catenin和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

組別基因蛋白ILKβ-cateninVEGFILKβ-cateninVEGF空白對(duì)照組45.9±5.142.6±2.387.4±6.544.6±3.837.5±3.686.3±5.8DMSO對(duì)照組44.6±4.741.8±3.586.3±5.846.8±4.536.7±4.285.9±6.1姜黃素5 μmol/L組43.7±3.439.6±4.183.1±6.143.4±5.135.2±3.683.4±6.3姜黃素20 μmol/L組27.6±2.9?24.3±5.6?47.2±5.4?27.5±3.418.9±2.742.1±2.9

*與空白對(duì)照組比較P<0.01

2.3 過(guò)表達(dá)ILK對(duì)姜黃素作用的影響

2.3.1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ILK后對(duì)細(xì)胞內(nèi)ILK的表達(dá)的影響 與空白對(duì)照(42.5±3.8)比較，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1后，A549細(xì)胞內(nèi)的ILK的蛋白表達(dá)水平為39.8±5.1，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-ILK后，可以見(jiàn)到細(xì)胞內(nèi)的ILK的蛋白含量達(dá)68.2±4.7，顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

2.3.2 過(guò)表達(dá)ILK后對(duì)姜黃素抑制A549細(xì)胞增殖的影響 空白對(duì)照組和DMSO對(duì)照組細(xì)胞增殖的抑制率均很低(0.2%)。與20 μmol/L姜黃素處理24 h時(shí)[(22.9±2.3)%]比較，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組細(xì)胞增殖抑制率為(23.4±1.8)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-ILK后，A549細(xì)胞的增殖明顯增強(qiáng)，即姜黃素對(duì)癌細(xì)胞的抑制率明顯減少，達(dá)到(14.7±1.2)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

A：不同濃度姜黃素作用24 h后對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)ILK、β-catenin和VEGF蛋白表達(dá)水平的影響； B：ILK、β-catenin和VEGF蛋白表達(dá)水平的光密度值的比較。*與空白對(duì)照組比較P<0.01

圖2姜黃素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)ILK、β-catenin和VEGF蛋白表達(dá)的影響

A：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ILK 后，A549細(xì)胞內(nèi)ILK蛋白表達(dá)的情況； B：轉(zhuǎn)然后，ILK蛋白表達(dá)的相對(duì)光密度值的比較。*與空白對(duì)照組比較P<0.01

圖3轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ILK后對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)ILK蛋白表達(dá)的影響

*與姜黃素處理組比較P<0.01

2.3.3 過(guò)表達(dá)ILK后對(duì)姜黃素抑制A549細(xì)胞內(nèi)ILK、β-catenin和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與20 μmol/L姜黃素處理24 h時(shí)比較，姜黃素+pcDNA 3.1 組細(xì)胞內(nèi)的ILK、β-catenin、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在姜黃素+pcDNA3.1-ILK組，細(xì)胞內(nèi)的ILK、β-catenin、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平則有顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3、4和圖5。

組別ILKβ-cateninVEGF20 μmol/L組姜黃素29.6±3.825.7±2.445.9±5.2pcDNA+姜黃素組28.7±4.124.8±3.746.5±6.6pcDNA-ILK+姜黃素組42.1±3.7?40.8±5.3?76.2±6.0?

*與20 μmol/L姜黃素組比較P<0.01

組別ILKβ-cateninVEGF20 μmol/L姜黃素組23.5±3.221.4±2.735.9±4.8姜黃素+pcDNA3.1組24.1±1.925.6±3.438.4±5.3姜黃素+pcDNA3.1-ILK組52.7±6.5?40.6±2.6?80.6±8.1?

*與20 μmol/L姜黃素組比較P<0.01

A：過(guò)表達(dá)ILK對(duì)姜黃素作用的A549細(xì)胞內(nèi)ILK、β-catenin和VEGF蛋白表達(dá)的影響； B：ILK、β-catenin和VEGF蛋白表達(dá)的相對(duì)光密度值的比較。*與20 μmol/L姜黃素比較P<0.01

圖5過(guò)表達(dá)ILK對(duì)姜黃素抑制A549細(xì)胞內(nèi)ILK、β-catenin和VEGF蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肺癌是發(fā)病率和病死率都增長(zhǎng)最快，對(duì)人類(lèi)健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，其中80%～85%的患者屬于NSCLC。NSCLC包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌。與小細(xì)胞癌相比，NSCLC的生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，轉(zhuǎn)移時(shí)間相對(duì)較晚。在NSCLC的治療中，常規(guī)的化療藥物不僅價(jià)格昂貴，而且往往容易產(chǎn)生耐藥性，且長(zhǎng)時(shí)間大劑量的用藥會(huì)給患者帶來(lái)嚴(yán)重的不良反應(yīng)；而另一種療法-放療仍然會(huì)給患者帶來(lái)巨大的不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存率。因此，尋找具有高效抗瘤活性且無(wú)(小)不良反應(yīng)的新型藥物是目前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，而從天然的植物、中草藥中提取的有效的抗腫瘤成分就受到了廣泛關(guān)注。

姜黃素是從多種中藥根莖中提取的一種多酚類(lèi)化合物。姜黃素?fù)碛袕V泛的生物學(xué)活性，抗腫瘤活性也包含在內(nèi)。研究也證實(shí)，姜黃素對(duì)肺癌，特別是NSCLC有顯著的抑制作用，其機(jī)制多涉及了姜黃素的抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的自噬性死亡等。在本研究中，運(yùn)用MTT檢測(cè)姜黃素對(duì)人NSCLC A549增殖的影響，結(jié)果顯示了姜黃素可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖，且呈濃度-時(shí)間依賴(lài)性，這也與Cai等[13]研究結(jié)果相一致。

姜黃素?fù)碛袕V泛生物學(xué)活性的原因是因?yàn)榻S素?fù)碛卸囝?lèi)生物學(xué)靶點(diǎn)，比如：轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)，核因子-κB(NF-κB)、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體r(PPARr)等；炎癥因子類(lèi)，IL-1、IL-2、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)等；酶類(lèi)，環(huán)氧化酶-2(COX-2)、ATP激酶(ATPase)、血紅素加氧酶-1(HO-1)等；激酶類(lèi)，EGFR激酶、AMPK、Akt等[14]。ILK是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，主要分布于胞漿內(nèi)，其過(guò)度表達(dá)直接參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后等過(guò)程，被認(rèn)為是一種新型的癌基因。研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)利用siRNA-ILK[15]或ILK的小分子抑制劑[16]可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，因此，有學(xué)者認(rèn)為ILK可作為人類(lèi)癌癥的生物標(biāo)記物和治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[17]。本研究運(yùn)用 Western blot檢測(cè)了姜黃素對(duì)A549細(xì)胞中ILK表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)姜黃素可降低ILK mRNA和蛋白的表達(dá)；當(dāng)過(guò)表達(dá)ILK后，肺癌細(xì)胞的增殖力又明顯增強(qiáng)，且細(xì)胞內(nèi)的ILK mRNA和蛋白表達(dá)也顯著增加?？梢?jiàn)，過(guò)表達(dá)ILK逆轉(zhuǎn)了姜黃素對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖和細(xì)胞內(nèi)ILK mRNA和蛋白的抑制作用。

研究證實(shí)，Wnt/β-catenin是ILK介導(dǎo)的下游重要的通路之一[18]，而β-catenin是Wnt/β-catenin中最為重要的組成部分，主要存在于胞漿中。當(dāng)Wnt通路異常激活后，胞漿內(nèi)的β-catenin就會(huì)大量聚集，然后移入核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄因子，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移等過(guò)程。因此，β-catenin在胞漿內(nèi)濃度決定了Wnt通路的開(kāi)放與關(guān)閉，也被認(rèn)為是參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素[19]。研究也表明，姜黃素可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin抑制NSCLC或肺癌干細(xì)胞的增殖[20-21]，但具體的作用環(huán)節(jié)卻不清。而本研究結(jié)果顯示，姜黃素可抑制NSCLC A549細(xì)胞內(nèi)β-catenin的mRNA和蛋白水平的表達(dá)；而過(guò)表達(dá)ILK后，肺癌細(xì)胞內(nèi)的β-catenin的基因和蛋白水平又明顯增強(qiáng)。

惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移都離不開(kāi)新生的血管。新生的血管不僅為腫瘤帶來(lái)生長(zhǎng)所需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，帶走代謝廢物；而且還為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供必要的物質(zhì)條件。血管的生成離不開(kāi)體內(nèi)生長(zhǎng)因子、信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，其中作用最強(qiáng)、影響最大的就是VEGF。研究已經(jīng)證實(shí)了VEGF是Wnt/β-catenin通路中β-catenin進(jìn)入核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄的重要靶基因[22]。VEGF表達(dá)越高，則提示惡性腫瘤侵襲能力越強(qiáng)，促血管生成的作用也顯著，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移則越早；干預(yù)VEGF的生成及其作用或阻斷VEGF與其受體的結(jié)合則可抑制肺癌的血管生成，從而抑制生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[23-24]。本研究結(jié)果表明，姜黃素可抑制VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)；而過(guò)表達(dá)ILK后，VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)又明顯提高。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，姜黃素可通過(guò)下調(diào)ILK的表達(dá)抑制A549細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能是：下調(diào)ILK使Wnt/β-catenin信號(hào)通路失活，使得β-catenin的表達(dá)減少，進(jìn)而抑制下游靶基因VEGF的表達(dá)，最終抑制癌細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)探討了姜黃素抑制人NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用機(jī)制，為姜黃素防治NSCLC提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步開(kāi)展。