朱潔波， 董學(xué)花， 崔香丹， 金雪峰， 全吉淑， 尹學(xué)哲△

1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科(吉林延吉 133000)； 2延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院(吉林延吉 133002)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常見、病死率最高的惡性腫瘤之一。目前，手術(shù)切除是治療肝癌的主要方法，而肝癌的轉(zhuǎn)移往往導(dǎo)致失去手術(shù)時(shí)機(jī)[1]，因此研究肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，成為治療肝癌的重點(diǎn)方向。而且鄰近組織侵襲或轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官的特征，被認(rèn)為是惡性腫瘤至關(guān)重要的特征。而侵襲和轉(zhuǎn)移的過程，可能主要是因?yàn)榘┘?xì)胞獲得了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的特性，從而更易向周圍組織發(fā)生侵犯[2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過程的重要因子，使上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，提高侵襲和遷移能力[3-5]。中藥草蓯蓉主要生長(zhǎng)在我國(guó)的長(zhǎng)白山地區(qū)，具有補(bǔ)腎、潤(rùn)腸通便、滋補(bǔ)強(qiáng)身功效。草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷(IGBR)是草蓯蓉提取物中有效的藥理成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗應(yīng)激、肝保護(hù)及抗腫瘤等功效[6-8]。2017年10月至2018年6月，本研究擬檢測(cè)IGBR對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的SK-Hep1細(xì)胞EMT模型的影響，并探討有關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人肝癌細(xì)胞SK-Hep1(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)； IGBR(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院全吉淑教授惠贈(zèng))；E-cadherin、N-cadherin鼠單抗及Vimentin兔單抗(CST公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(納川科技有限公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM(HyClone公司)；TGF-β1(Peprotech公司)；4%組織細(xì)胞固定液、結(jié)晶紫(索萊寶科技有限公司)；顯微鏡(Olympus公司)； Hang Cell Culture Inserts、PVDF膜(密理博公司)；電泳儀、Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽(Bio Rad公司)，電泳槽(北京六一儀器廠)，凝膠顯像儀(Protein Simple公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人肝癌SK-Hep1 細(xì)胞株，將細(xì)胞復(fù)蘇后置于10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h換1次培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將人肝癌細(xì)胞隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、模型組(TGF-β1組)和IGBR組。對(duì)照組為培養(yǎng)液處理，TGF-β1組為10 ng/mL TGF-β1處理48 h，IGBR組為10 ng/mL TGF-β1+500 μg/mL IGBR處理48 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué) 顯微鏡下觀察對(duì)照組、TGF-β1組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.3.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 6孔板中每孔加入1×106個(gè)SK-Hep1細(xì)胞，12 h后細(xì)胞貼壁取出6孔板，垂直板內(nèi)劃平行線后，換新的培養(yǎng)液及含500 μg/mL的IGBR培養(yǎng)液。分別在0、24和48 h顯微鏡下拍照記錄。

1.3.3 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 上室加50 μL基質(zhì)膠鋪平，上室中加入2×105·mL-1的SK-Hep1細(xì)胞懸液100 μL。下室加入600 μL培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后取出，4%組織細(xì)胞提取液固定20 min，0.5%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照記錄。

1.3.4 Western blot檢測(cè)各蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白后檢測(cè)蛋白濃度，配置6%濃縮膠和10%的分離膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，分別加入1∶1 000稀釋的一抗E-cadherin、 N-cadherin和Vimentin，4℃過夜；加入1∶1 000稀釋的二抗，室溫下孵育2 h；在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，分析各抗體條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1誘導(dǎo)前后SK-Hep1形態(tài)學(xué)變化 對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，可見卵圓形、多角形等不規(guī)則的上皮樣形態(tài)；TGF-β1組細(xì)胞核變大，細(xì)胞多呈梭形，細(xì)胞數(shù)目增多。見圖1。

A：對(duì)照組；B:TGF-β1組

2.2 IGBR對(duì)SK-Hep1細(xì)胞EMT模型遷移能力的影響 實(shí)驗(yàn)24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，TGF-β1組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)增加(P<0.01)；與TGF-β1組相比，IGBR組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)48 h時(shí)，與對(duì)照組相比，TGF-β1組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)增加(P<0.01)；與TGF-β1組相比，IGBR組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)減少(P<0.01)。見圖2、3。

圖2 IGBR對(duì)SK-Hep1細(xì)胞EMT模型遷移能力的影響(×40)

*與對(duì)照組比較P<0.01；與TGF-β1組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖3 IGBR對(duì)SK-Hep1細(xì)胞EMT模型遷移能力的影響

2.3 IGBR對(duì)SK-Hep1細(xì)胞EMT模型侵襲能力的影響 與對(duì)照組比較，TGF-β1組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)增多(P<0.01)；與TGF-β1組比較，IGBR組發(fā)生侵襲的細(xì)胞減少(P<0.01)。見圖4、5。

2.4 IGBR對(duì)EMT相關(guān)蛋白N-cadherin、Vimentin和E-cadherin表達(dá)影響 SK-Hep1細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，TGF-β1組E-cadherin表達(dá)降低(P<0.01)，N-cadherin、Vimentin表達(dá)增加(P<0.01)。與TGF-β1組相比，IGBR組E-cadherin表達(dá)增加(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin表達(dá)降低(P<0.05)，見圖6。

3 討論

肝癌是全球重要的健康負(fù)擔(dān)，每年約有84.1萬新發(fā)病例和78.2萬死亡病例。世界范圍內(nèi)大多數(shù)地區(qū)，男性的發(fā)病率和病死率更高，約高出女性的2～3倍。肝癌發(fā)生率最高的地區(qū)是東亞，其次是東南亞及非洲北部[9]。在中國(guó)，肝癌是第四大常見的惡性腫瘤，發(fā)生率僅次于肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌。占中國(guó)惡性腫瘤死亡的第2位，僅次于肺癌。男性中，肝癌好發(fā)于44歲及以下，死亡以小于60歲者人數(shù)最多。而女性中，30歲以下肝癌的死亡人數(shù)最多[10]。

EMT與許多過程相關(guān)，包括胚胎發(fā)育、傷口愈合和組織修復(fù)以及腫瘤的遷移和侵襲等過程[11]。EMT是指在特定條件下，上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)特性，使上皮間黏附性降低，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，從而更易突破基底膜，向周圍組織侵襲的變化。EMT不僅參與胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、器官纖維化及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還參與腫瘤的遷移和侵襲等過程[12-13]。侵襲和轉(zhuǎn)移鄰近組織的過程，是惡性腫瘤的關(guān)鍵特征，這一過程主要依賴于具有癌細(xì)胞獲得EMT特征[14]。本研究中，采用10 ng/mL的TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SK-Hep1 48 h后發(fā)生EMT，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似，即10 ng/mL的TGF-β1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞48 h，EMT效果最佳[15]。

A：對(duì)照組；B：TGF-β1組；C：IGBR組

*與對(duì)照組比較P<0.01；△與TGF-β1組比較P<0.01

參與EMT腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物包括E-cadherin、N-cadherin和Vimentin[16]。E-cadherin在上皮細(xì)胞黏附和凋亡中起重要作用，其功能的喪失是癌癥進(jìn)展的主要原因[17]。N-cadherin是一種跨膜糖蛋白，即通常在神經(jīng)黏膜和間充質(zhì)衍生組織中表達(dá)，在許多過程中起的關(guān)鍵作用，如細(xì)胞-細(xì)胞黏附，細(xì)胞的遷移和侵襲[18]。N-cadherin被認(rèn)為是EMT的重要標(biāo)志。據(jù)報(bào)道，N-cadherin的表達(dá)，可以加速癌細(xì)胞的遷移和侵襲，這與癌細(xì)胞E-cadherin功能是相反的[19]。這種下調(diào)E-cadherin和上調(diào)的過程N(yùn)-cadherin，被稱為鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換，是EMT的特征[20]。Vimentin在大多數(shù)細(xì)胞類型，特別是腫瘤細(xì)胞中顯著表達(dá)[21]。發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)歷上皮標(biāo)志物E-cadherin水平的降低，間充質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin，Vimentin水平的增加。EMT標(biāo)志物的表達(dá)預(yù)示著原發(fā)性腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后不良[22]。本研究觀察了IGBR可以導(dǎo)致模型組E-cadherin表達(dá)量增加，減弱TGF-β1誘導(dǎo)SK-Hep1細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及EMT的程度。

*與對(duì)照組比較P<0.01；△與模型組比較P<0.05

草蓯蓉主要生長(zhǎng)在我國(guó)的長(zhǎng)白山地區(qū)，列屬當(dāng)科本草植物。近年來實(shí)驗(yàn)研究顯示，草蓯蓉具有抗應(yīng)激、抗氧化、抗肝臟纖維化及肝保護(hù)的功效，同樣在肝癌大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，抑制了腫瘤的發(fā)展，提高肝癌大鼠的生存率[23-24]。IGBR是草蓯蓉提取物中有效的藥理成分，是抗腫瘤作用的重要化學(xué)物質(zhì)之一[25]。本研究中，IGBR對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞株SK-Hep1的EMT模型遷移及侵襲能力的影響，并在顯微鏡下觀察SK-Hep1觀察TGF-β1誘導(dǎo)前后的細(xì)胞形態(tài)變化，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力，Transwell檢測(cè)侵襲能力，Western blot檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。

綜上所述，500 μg/mL的IGBR可以抑制SK-Hep1細(xì)胞的遷移及侵襲，其機(jī)制可能與上調(diào)E-cadherin、下調(diào)N-cadherin和Vimentin有關(guān)。