林慧貞，黃如春，林生，梁育青

（莆田市第一醫(yī)院檢驗科，福建 莆田 351100）

腎病綜合征（Nephriticsyndrome，NS）是一組以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和水腫為主的臨床癥狀，即典型的三高一低,大量蛋白尿（≥3.5g/d)和低蛋白血癥（≤30g/L)為此病的必備條件。由于腎病綜合征患者體內(nèi)大量蛋白丟失和高脂血癥，常引起機體的凝血、抗凝及纖溶系統(tǒng)之間的失衡，從而易誘發(fā)血栓的形成。血栓及栓塞性癥狀是腎病綜合征患者的常見并發(fā)癥，其發(fā)生率為8.5%～38.0%[1-2]。本文旨在通過對D－二聚體聯(lián)合胱抑素C（Cys-C）和肌酐（Cr）等腎功能損害相關(guān)指標的檢測，觀察其對NS患者并發(fā)血栓栓塞的影響，為腎病綜合征發(fā)生血栓的預(yù)警和診斷提供臨床診斷依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院住院和門診收治的腎病綜合征患者62例，其中男性患者38例，女性患者24例，年齡26～78歲，平均年齡為45.3±18.6歲。并選擇同期健康體檢者80例作為對照組（排除可能影響D－二聚體和Cys-C水平的因素：急性心肌梗死、肺栓塞等栓塞性疾病、嚴重的心、腎、肝功能不全及任何抗凝藥物等），其中男45例，女35例，年齡25～77歲，平均年齡為 44.7±19.1歲，兩組的性別、年齡等資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法 空腹采集肘靜脈血2ml于3.8%枸櫞酸鈉抗凝管（抗凝劑與血比例為1：9），離心，分離留取血漿，用于D－二聚體的測定；同時取3ml靜脈血注入促凝管中,離心，分離血清，用于Cys-C和肌酐的測定。

1.3 儀器和試劑 采用德國羅氏C8000全自動生化分析儀及其原裝配套試劑檢測Cys-C(免疫比濁法)及Cr(酶法)。D－二聚體檢測采用免疫比濁法,Stago compact全自動血凝儀儀器及其原裝配套D-二聚體試劑。Cys-C參考值范圍為0.5～1.5 mg/L,Cr為 45～133 μmol/L，D-D 為 0～0.5 mg/L。

1.4 免疫熒光法檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2用4%的多聚甲醛固定組織切片15min，PBS浸洗玻片 3次，每次 3min；0.5%Triton X-100(PBS配制 )室溫通透20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室溫封閉30min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗 （抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體）并放入濕盒，4℃孵育過夜；加熒光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20～37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS17.0版本的統(tǒng)計軟件進行處理和分析,計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，采用Spearman相關(guān)性進行兩變量的相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中 Cys-C、Cr、D－二聚體的檢測結(jié)果 62例腎病綜合征患者中Cys-C、Cr、D－二聚體均明顯高于對照組的水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。同時有21例D－二聚體大于0.5 mg/L，陽性率33.9%,見表1。

表1 各組中Cys-C、Cr、D－二聚體的檢測結(jié)果

2.2 腎病綜合征患者血清D－二聚體與Cys-C成正相關(guān)關(guān)系 r＝0.3300，P＝0.0006,見圖 1。

圖1 血清D－二聚體與Cys-C成正相關(guān)關(guān)系

2.3 D－二聚體增高的腎病綜合征患者的腎組織脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2表達情況 21例D－二聚體增高(>0.5 mg/L)的腎病綜合征患者的腎組織中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2表達的陽性率為95.2%（20/21）,其他40例D－二聚體增高(<0.5 mg/L)脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的陽性率為17.5%（7/40）,D－二聚體增高病例組中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2表達的陽性率明顯高于D－二聚體正常組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 免疫熒光檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2表達情況A：脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2表達；B：DAPI核染

3 討論

腎病綜合征是內(nèi)科常見的一種以大量蛋白尿、低白蛋白血癥、高脂血癥和高度水腫為主要臨床表現(xiàn)的一組臨床癥狀群。由于腎病綜合征患者大量蛋白流失導(dǎo)致抗凝血酶Ⅲ缺乏,高脂血癥也可以導(dǎo)致血液粘稠度增加，機體血流動力學(xué)改變，內(nèi)皮細胞的損傷等等眾多的因素促成患者體內(nèi)處于一個高凝狀態(tài),為此易發(fā)生血栓形成及栓塞性的并發(fā)癥。靜脈血栓形成是腎病綜合征常見并發(fā)癥之一，國內(nèi)外文獻報道腎病綜合征患者發(fā)生靜脈血栓栓塞的發(fā)病率為3%～69%[3-4]，可誘發(fā)下肢深靜脈血栓形成 （DVT）、 肺栓塞 （PE）、 腎靜脈血栓（RVT）或者其他部位的血栓栓塞，其中以腎靜脈血栓（RVT）最常見，下肢深靜脈血栓形成（DVT）和肺栓塞（PE）次之，冠狀血管、腦血管等一些器官也可以形成血栓，是最嚴重的并發(fā)癥之一。血栓的形成可以嚴重影響到腎病綜合征的預(yù)后,甚至危及生命。因此，早期診斷、治療和預(yù)防血栓的形成對臨床腎病綜合征患者的預(yù)后起到非常重要的作用，值得深入研究。

腎病綜合征患者血栓的形成是由多種機制參與的，國內(nèi)外研究學(xué)者認為腎病綜合征易發(fā)生血栓主要有以下幾方面原因[5-6]：⑴腎病綜合征患者大量蛋白尿?qū)е卵褐械哪蜃英?、Ⅺ、Ⅻ和凝血酶原、抗凝血酶原等減少，并通過凝血系統(tǒng)之間的相互刺激作用引發(fā)凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ增加等因素使得機體處于一種高凝的狀態(tài)；⑵蛋白S、蛋白C和組織因子途徑抑制物由于機體的原因合成減少，使得機體中的抗凝功能減弱，同時又由于纖維蛋白、纖維蛋白溶酶原和組織型先溶酶原激活劑降低導(dǎo)致纖溶系統(tǒng)發(fā)生異常；⑶血漿清蛋白的丟失可代償性誘發(fā)纖維蛋白原的增加，造成腎病綜合征患者高纖維蛋白原血癥，從而促進血小板的聚合能力，引發(fā)血液粘度增加，并誘發(fā)血流動力學(xué)改變，促使患者體內(nèi)處于高凝集狀態(tài)；⑷抗凝血酶（AT）Ⅲ由于相對分子質(zhì)量極小，其有可能隨著患者大量蛋白尿丟失，血管內(nèi)凝血作用增強使得AT加速消耗，從而無法抑制凝血酶作用。D－二聚體是臨床上常用于反應(yīng)機體內(nèi)高凝和繼發(fā)纖溶狀態(tài)的一種指標，D－二聚體的升高表明機體血管內(nèi)有活化的血栓形成及纖維溶解動作，因D－二聚體是由纖維蛋白單體經(jīng)活化因子交聯(lián)后，由纖溶酶水解而產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，它主要反映纖維蛋白溶解功能[7-8]。Cys-C是由機體有核細胞產(chǎn)生的一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，在各種組織的有核細胞和體液中廣泛存在，且其產(chǎn)生率恒定。血清Cys-C是目前反映腎小球濾過率變化最為理想的內(nèi)源性標志物，由于人體血液循環(huán)中的Cys-C僅經(jīng)腎小球濾過而被清除，并在近曲小管被重吸收，但重吸收后被完全代謝分解，不返回血液，是一種能靈敏反映腎小球濾過率變化的內(nèi)源性標志物，是評估腎功能損害的較好指標，Cys-C值越高，腎功能損害越嚴重[9-10]。

評估腎病綜合征的體內(nèi)是否處于高凝狀態(tài)和腎功能的損害情況是目前臨床治療腎病綜合征關(guān)注的兩大問題。腎病綜合征狀態(tài)下由于大量的蛋白流失，體內(nèi)抗凝物質(zhì)會發(fā)生改變，誘發(fā)凝血系統(tǒng)、抗凝系統(tǒng)和抗纖溶系統(tǒng)之間的失衡，血流動力學(xué)的改變等等常常導(dǎo)致腎病綜合征患者體內(nèi)處于一種高凝狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，62例腎病綜合征患者中有21例D－二聚體大于0.5 mg/L，陽性率為33.9%，同時患者血漿中D－二聚體的水平為(0.87±0.46 mg/L)明顯高于對照組的水平 （0.38±0.16mg/L)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.34,P=0.017） ,血漿中D－二聚體的增加表明腎病綜合征患者體內(nèi)雙重激活了纖溶系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)，有形成血栓的跡象，應(yīng)引起重視[11-13]。本文數(shù)據(jù)還顯示62例腎病綜合征患者中 Cys-C （4.37±1.42 mg/L）、Cr的水平均明顯高于對照組的水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，表明腎病綜合征患者有不同程度的腎功能損傷。同時數(shù)據(jù)結(jié)果顯示D－二聚體與Cys-C呈正相關(guān)性，與Cr相關(guān)性不明顯，證實了D－二聚體、Cys-C與血栓栓塞的發(fā)生、發(fā)展存在一定關(guān)系，而肌酐可能與血栓形成的關(guān)系不太大。腎病綜合征患者存在活化的血栓形成和纖溶亢進，有血栓栓塞風險，且這種風險隨著腎功能損害程度的增高而增大,近年來許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Cys-C與心血管疾病之間有一定關(guān)系，因Cys-C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族成員之一，能激活中性粒細胞，參與炎癥反應(yīng)過程，可損傷內(nèi)皮細胞進而使一氧化氮（NO）產(chǎn)生減少,同時還可調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶的活性，參與調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生與降解的動態(tài)平衡，通過炎癥反應(yīng)從而改變凝血因子的功能參與血栓形成[14-15]。

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2是一種新的炎癥酶，主要由巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞分泌，主要參與磷脂重建及生物膜的穩(wěn)定。腎病綜合征合并血栓患者高表達脂蛋白相關(guān)磷脂酶 A2，而脂蛋白相關(guān)磷脂酶 A2能水解氧化型LDL,產(chǎn)生溶血卵磷脂和氧化型游離脂肪酸，易導(dǎo)致血栓形成。

綜上所述，如何有效的診斷、治療及預(yù)防血栓形成對于腎病綜合征患者的預(yù)后起著極其重要的作用,Cys-C和D－二聚體檢測結(jié)果既可作為判斷高凝及纖溶亢進狀態(tài)也可以用于評估腎病綜合征患者血栓形成風險和腎臟損害程度指標，Cys-C和D－二聚體可用于臨床腎病綜合征患者血栓形成的預(yù)測檢驗因子。