薛娟,高磊,王艷秋

（1.河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 4710002；河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 洛陽(yáng) 471000；3.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 洛陽(yáng) 471000）

血管瘤是由胚胎期間成血管細(xì)胞增生而形成的的良性腫瘤,新生兒發(fā)病率為1%～2%,女性多見,男女比例約為1：3[1,2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[3]發(fā)生于口腔頜面部的血管瘤占全身的60%，發(fā)生于軀干的血管瘤占全身的25%,發(fā)生于四肢的血管瘤占全身的15%,其中大多數(shù)發(fā)生于口腔黏膜、面部皮膚、皮下組織、舌唇等表淺位置，易造成容顏缺損，也有少數(shù)發(fā)生于頜骨內(nèi)或深部組織，可影響機(jī)體功能甚至危及生命。有文獻(xiàn)報(bào)道[4]血管瘤具有血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）增殖和新生血管生成的特點(diǎn)，而血管生成需血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和血管生成素(Ang)參與。大量研究證明，VEGF、Ang-2在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）[5]、多發(fā)性骨髓瘤(MM)[6]、子宮肌瘤[7]等腫瘤組織中異常表達(dá),提示VEGF、Ang-2與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于VEGF、Ang-2在血管瘤中表達(dá)的研究較少。因此，本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法及RT-PCR檢測(cè)VEGF、Ang-2在毛細(xì)血管型血管瘤標(biāo)本、毛細(xì)血管畸形標(biāo)本及正常皮膚組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，旨在探討VEGF、Ang-2應(yīng)用于血管瘤診療的意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 收集2017年1月-2017年9月我院病理科存檔的毛細(xì)血管型血管瘤組織標(biāo)本83例為毛細(xì)血管型血管瘤組，請(qǐng)其中男39例,女44例；年齡 1個(gè)月~11歲,平均年齡（5.49±1.23）歲。 同期毛細(xì)血管畸形組織標(biāo)本56例為毛細(xì)血管畸形組，其中男26例，女30例；年齡1個(gè)月~12歲,平均年齡（5.96±1.06）歲。另取同期含有正常血管的皮膚組織標(biāo)本56例為對(duì)照組，其中男27例,女29例；年齡 1個(gè)月~13歲,平均年齡（6.11±1.45）歲。 入選標(biāo)準(zhǔn)：⑴行手術(shù)切除的皮膚毛細(xì)血管型血管瘤患者均經(jīng)病理檢查證實(shí)，且無(wú)其他腫瘤病史；⑵毛細(xì)血管型血管瘤部位為頜面部、四肢、軀干；⑶毛細(xì)血管型血管瘤處于增殖期；⑷入組者資料完整；⑸本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴毛細(xì)血管型血管瘤處于退化期；⑵術(shù)前口服糖皮質(zhì)激素；⑶合并內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。三組標(biāo)本來(lái)源者性別、年齡比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞0.05）。

1.2 主要試劑 兔抗人VEGF單克隆抗體（Signalway antibody）、山羊血清（Epit Mics）、DAB 顯色試劑盒 （北京中杉金橋生物有限公司）、羊抗鼠IgG（Cell signaling）、兔抗人 Ang-2 單克隆抗體（上海仁捷生物科技有限公司）、PBS磷酸緩沖液（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）、二甲苯（上?；鄯f生物科技有限公司）、蘇木精染色液（上海譜振生物科技有限公司）、梯度酒精（廣州維恩基因科技有限公司）、中性樹脂（梅州市守合科技有限公司）、檸檬酸鈉緩沖液（上?；巧锟萍加邢薰荆?、VEGF引物 （上海玉博生物科技有限公司）、Ang-2引物（德國(guó)Qiagen）、異丙醇（深圳聚正科技有限公司）、總RNA提取試劑盒（北京博凌科為生物科技有限公司）、1.5%瓊脂糖 （美國(guó)AMRESCO公司）、RTPCR擴(kuò)增試劑盒（北京厚生博泰科技有限公司）。

1.3 RT-PCR 取各組標(biāo)本按總RNA提取試劑盒操作步驟提取總RNA,檢測(cè)RNA濃度及純度,取5μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA后行 RT-PCR反應(yīng)，PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 4min，94℃變性 60S，58℃退火 60s，72℃延伸 60 S，32 次循環(huán)。 將 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳60min，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，以目的基因與GAPDH吸光度比值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。VEGF、Ang-2mRNA相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法：基因相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct。

1.4 免疫組織化學(xué)SP染色法 將各組標(biāo)本用組織切片機(jī)切成4μm連續(xù)切片，脫蠟，高壓抗原修復(fù)，PBS漂洗，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活，加山羊血清封閉，滴加兔抗人VEGF單克隆抗體（濃度1：200）和兔抗人 Ang-2單克隆抗體 （濃度1：200），4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗，滴加生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG（濃度 1：100），37℃孵育 60 min，PBS 漂洗，DAB 顯色5min，PBS終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察VEGF、Ang-2蛋白表達(dá)。判定標(biāo)準(zhǔn)：由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富具有獨(dú)立執(zhí)業(yè)資格的病理科醫(yī)生對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)定和復(fù)核。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，按著色細(xì)胞百分率記分：陽(yáng)性細(xì)胞率＜5%記作0分，陽(yáng)性細(xì)胞率5%～25%記作1分，陽(yáng)性細(xì)胞率26%～50%記作2分，陽(yáng)性細(xì)胞率＞50%記作3分。按著色強(qiáng)度記分：0分為不著色，淺黃色記作1分，棕黃色記作2分，棕褐色記作3分。著色細(xì)胞百分率記分與著色強(qiáng)度記分相乘為最終得分：乘積＜4分為陰性表達(dá)，乘積≥4為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用spss22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)或單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組VEGF mRNA表達(dá)水平 VEGF mRNA在毛細(xì)血管型血管瘤組、毛細(xì)血管畸形組中表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05）；VEGF mRNA在毛細(xì)血管型血管瘤組中表達(dá)量顯著高于毛細(xì)血管畸形組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）,見表 1、圖1。

表1 各組VEGF mRNA表達(dá)水平(）

表1 各組VEGF mRNA表達(dá)水平(）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與毛細(xì)血管畸形組比較，#P＜0.05

組別 n毛細(xì)血管型血管瘤組毛細(xì)血管畸形組對(duì)照組83 56 56 FP/ /VEGF mRNA 1.28±0.09*#1.23±0.07*1.00±0.06 235.746＜0.001

圖1 各組VEGF mRNA表達(dá)水平比較

2.2 各組VEGF蛋白表達(dá)水平 VEGF蛋白定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色顆粒。VEGF蛋白在毛細(xì)血管型血管瘤組、毛細(xì)血管畸形組中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；VEGF蛋白在毛細(xì)血管型血管瘤組中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于毛細(xì)血管畸形組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表 2、圖 2。

2.3 各組Ang-2 mRNA表達(dá)水平 Ang-2 mRNA在毛細(xì)血管型血管瘤組、毛細(xì)血管畸形組中表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；Ang-2 mRNA在毛細(xì)血管型血管瘤組中表達(dá)量顯著高于毛細(xì)血管畸形組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表3、圖 3。

圖2 毛細(xì)血管型血管瘤組及毛細(xì)血管畸形組VEGF蛋白表達(dá)水平（×400）

表2 各組VEGF蛋白表達(dá)水平[n(%)]

表3 各組Ang-2 mRNA表達(dá)水平(）

表3 各組Ang-2 mRNA表達(dá)水平(）

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與毛細(xì)血管畸形組比較，#P<0.05

組別 n毛細(xì)血管型血管瘤組毛細(xì)血管畸形組對(duì)照組83 56 56 HP/ /Ang-2 mRNA 0.56±0.13 0.34±0.08 0.11±0.05 26.438<0.001

圖3 各組Ang-2 mRNA表達(dá)水平比較

2.4 各組Ang-2蛋白表達(dá)水平 Ang-2蛋白定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,呈棕黃色或棕褐色顆粒。Ang-2蛋白在毛細(xì)血管型血管瘤組、毛細(xì)血管畸形組中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；Ang-2蛋白在毛細(xì)血管型血管瘤組中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于毛細(xì)血管畸形組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見表 4、圖 4。

圖4 毛細(xì)血管型血管瘤組及毛細(xì)血管畸形組Ang-2蛋白表達(dá)水平（×200）

表4 各組Ang-2蛋白表達(dá)水平[n(%)]

2.5 VEGF、Ang-2在毛細(xì)血管型血管瘤中表達(dá)的相關(guān)性 VEGF、Ang-2在毛細(xì)血管型血管瘤中表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05），見表 5。

表5 VEGF、Ang-2在毛細(xì)血管型血管瘤中表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

血管瘤是嬰幼兒常見的良性腫瘤之一，其生長(zhǎng)迅速時(shí)易破壞周圍組織，引發(fā)潰瘍、感染、出血等并發(fā)癥[8]。臨床上治療血管瘤方法很多，手術(shù)切除、放射療法、局部封閉療法、冷凍療法等均有一定療效，但由于血管瘤多發(fā)生于指趾、眼瞼、舌頭、口唇、鼻尖等特殊部位，如進(jìn)行手術(shù)切除、冷凍療法會(huì)導(dǎo)致組織缺損、皮膚萎縮、瘢痕形成，從而影響容貌或機(jī)體功能[9]。因此，從分子標(biāo)志物角度研究血管瘤發(fā)病機(jī)制可為臨床辨別血管瘤、指導(dǎo)血管瘤治療尋找有效幫助。

目前，對(duì)于血管瘤的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有研究認(rèn)為[10]其發(fā)生與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）等血管生成因子及血管抑制因子 (AIF)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)有關(guān)。有文獻(xiàn)提到[11]血管瘤是由殘余的胚胎成血管細(xì)胞向鄰近組織侵入,形成內(nèi)皮樣條索，經(jīng)管化后與遺留下的血管相連而形成,血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生成在其病理演變過(guò)程中扮演著重要角色。而Taktak-Benamar A等[12]發(fā)現(xiàn)VEC增殖可由VEGF或Ang水平異常引起。VEGF是一種由兩條相同肽鏈通過(guò)二硫鍵構(gòu)成的外分泌二聚體糖蛋白,也是一種可擴(kuò)散的內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原，能提高血管內(nèi)皮滲透性，引起血漿蛋白外滲。李莉等[13]研究中提到VEGF為目前已知最強(qiáng)的可直接促進(jìn)血管生成的血管生成因子（AF），其在多發(fā)性骨髓瘤、子宮肌瘤等腫瘤患者血液或癌組織中能夠檢測(cè)到，且與患者臨床病理分期密切相關(guān)。相關(guān)研究顯示[14]VEGF在血管生成、維持血管內(nèi)皮功能方面可發(fā)揮重要作用，其與VEC上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(Flt-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（Flk-1）高親和力結(jié)合后，可形成受體二聚體，發(fā)生自體酪氨酸磷酸化，誘導(dǎo)VEC增殖、移行和分化形成管腔樣結(jié)構(gòu)。Fagiani E等[15]采用免疫組化法檢測(cè)VEGF蛋白在增生期、消退期血管瘤中表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)消退期血管瘤VEGF蛋白表達(dá)明顯低于增生期血管瘤,提示VEGF與血管瘤的血管增生有密切關(guān)系,這在本研究中也得到了證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，VEGF在毛細(xì)血管型血管瘤中呈陽(yáng)性表達(dá)，著色較強(qiáng)，且其表達(dá)水平明顯高于毛細(xì)血管畸形組及對(duì)照組。分析其原因可能是因?yàn)?在VEGF刺激下血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體Flk-1迅速磷酸化，從而激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，加速VEC有絲分裂，造成VEC大量增殖，導(dǎo)致腫瘤形成[16]。

Ang是一族分泌型的生長(zhǎng)因子，包括 Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4四種分子，其可維持血管完整性，能刺激血管生長(zhǎng)。Ang-2為Ang家族中的一種，主要分布于卵巢、子宮、胎盤等與血管重建有關(guān)的部位，有研究顯示[17]Ang-2是腫瘤血管新生起始及加強(qiáng)的重要因素，與腫瘤血管形成數(shù)目、臨床分期關(guān)系密切。結(jié)合相關(guān)資料[18]我們分析Ang-2對(duì)腫瘤血管生成的影響可能與局部微環(huán)境有關(guān)，當(dāng)VEGF存在時(shí)，Ang-1的天然拮抗劑Ang-2可拮抗Ang-1，破壞血管的穩(wěn)定性，促進(jìn)新生血管形成；當(dāng)VEGF缺乏時(shí)，Ang-2可抑制Ang-1，導(dǎo)致血管斷裂，促使血管消退。Solecki G等[19]研究中提到，過(guò)度表達(dá)Ang-2，鼠血管結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，由正常樹狀變?yōu)橄x蛀狀，VEC從血管表面分離堆積到一起，提示Ang-2與血管變化密切相關(guān)。本研究中，Ang-2蛋白定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色顆粒，且Ang-2蛋白及mRNA毛細(xì)血管型血管瘤組中表達(dá)水平均顯著高于毛細(xì)血管畸形組、對(duì)照組，提示Ang-2對(duì)病變血管的形成可能具有促進(jìn)作用。

綜上，VEGF、Ang-2在血管瘤中均呈高表達(dá)，二者相互作用可促進(jìn)血管瘤增殖，其表達(dá)情況為臨床診療血管瘤提供了新的方向。