王洪建 ，劉小慧 ，劉燕飛 ，李智全 ，張子弋 ，牛新清

（1.濮陽市人民醫(yī)院血液病研究所，河南 濮陽 457000 2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000）

相關(guān)數(shù)據(jù)表示[1]，我國中年男性因癌癥死亡的人數(shù)高達(dá)約150萬，其中因肺癌死亡占死亡人數(shù)的約35.0%，女性患者死亡約到80萬，因肺癌死亡的比例約為25.0%。由以上數(shù)據(jù)可見肺癌對(duì)我國人群健康危害極大。相關(guān)資料表示[2]，機(jī)體中的主要效應(yīng)細(xì)胞為CD4+T淋巴細(xì)胞，分為Th1和Th2兩種，Th1主要分泌IL-2、IFN-γ或TNF-β等細(xì)胞因子輔助細(xì)胞免疫，Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6或IL-10等細(xì)胞因子輔助體液免疫[3]。相關(guān)研究表示[4]，VEGF在腫瘤的表達(dá)中和其轉(zhuǎn)移和生長有一定的相關(guān)性。本研究將對(duì)以上幾種指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測，探究Th1與Th2細(xì)胞因子及VEGF聯(lián)合檢測在肺癌患者病情發(fā)生發(fā)展中的臨床應(yīng)用價(jià)值。報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 入組患者均為2017年6月至2018年6月之間，在我院治療的肺癌患者114例，男65例，女 49 例，年齡 27-76 歲，平均（50.41±26.06）歲，設(shè)為觀察組，均經(jīng)過我院病理活檢和基因檢測確診為肺癌，其中有腺癌55例，鱗癌44例，小細(xì)胞癌10例，其余5例為其它類型肺癌（肺泡細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌），根據(jù)美國國立綜合癌癥的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將本研究標(biāo)本分為I/II級(jí)共50例，III/IV級(jí)共64例。將相同時(shí)間在我院體檢的健康者作為對(duì)照組，共92例，男 51，女41例，年齡 24~76歲，平均（47.89±25.00）歲。 見表 1。

表1 兩組患者一般資料對(duì)比情況

1.2 病例組入選標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 入選標(biāo)準(zhǔn)：病例組標(biāo)本均經(jīng)過我院病理活檢和基因檢測確診為肺癌患者；患者有明確的病理分型以及臨床分期；患者未接受過相關(guān)的免疫治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除伴有肺部嚴(yán)重疾病感染和肺結(jié)核的患者。

1.3 研究方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 CBA細(xì)胞因子檢測試劑盒 （購于美國BD生物科技有限公司）、BECKMANCOULTER-NAVIOS流式細(xì)胞儀（購于河南省萊福茵生命科學(xué)有限公司）、低溫離心機(jī)、漩渦混勻器、移液器、微量精密加樣器。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)原理 CBA方法[5]是指一系列具有相同熒光素不同熒光強(qiáng)度的微球組合,微球大小體積相同,在相同熒光強(qiáng)度的微球上包被有適合于檢測各種細(xì)胞因子的特異性抗體。同理，在其他熒光強(qiáng)度的微球上包被有其他不同的特異性抗體，將包被有不同抗體的微球混合在一起加入到測試樣本中，使細(xì)胞溶解，各種蛋白或細(xì)胞內(nèi)成分釋放出來到懸浮溶液中，被捕獲微球捕獲，就可以利用CBA方法進(jìn)行多種細(xì)胞因子的檢測。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)操作 血漿準(zhǔn)備：EDTA-K2抗凝管2毫升全血標(biāo)本。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：建立系列細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用定量稀釋液稀釋相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品。微球準(zhǔn)備：各試管全血10μl加破膜劑5μl混合室溫靜置15min，加捕獲微球 5μl混合室溫暗視野靜置10min，轉(zhuǎn)移混合的微球懸液到各個(gè)流式測定管中。加藻紅蛋白（PE）檢測試劑5μl于檢測管，室溫避光孵育3h。用流式細(xì)胞分析液洗滌樣本，離心，棄去廢液。加分析液500μl震蕩混勻，立即上機(jī)檢測。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察標(biāo)準(zhǔn)：⑴統(tǒng)計(jì)兩組患者細(xì)胞中的Th1型和Th2型細(xì)胞因子和血清中VEGF的表達(dá)情況。⑵統(tǒng)計(jì)觀察組患者的不同臨床特征中細(xì)胞因子的表達(dá)差異性，其中包括年齡、病理分型、臨床分期等。⑶觀察肺癌患者血漿中的細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS20.0軟件對(duì)兩組細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，若兩組相關(guān)指標(biāo)表達(dá)情況均符合正態(tài)分布,則進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，兩組間對(duì)比則應(yīng)用t檢驗(yàn)；若兩組相關(guān)指標(biāo)表達(dá)情況不符合正態(tài)分布，則用中位數(shù)±四分位間距進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間比較利用秩和檢驗(yàn)。利用方差分析對(duì)觀察組細(xì)胞因子不同分型組間進(jìn)行比較。應(yīng)用person相關(guān)法來檢測細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性,若P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血漿中相關(guān)因子表達(dá)水平 Th1型中,觀察組血漿中的IFN-γ、IFN-a濃度均顯著高于對(duì)照組（t=9.224、7.887，P=0.001、0.031）,觀察組患者的血漿中IL-2表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組 （t=-12.524，P=0.000）， 組間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）；而兩組患者血漿中的IL-12P40表達(dá)情況差別不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Th2型中，觀察組患者血漿中的IL-6、IL-8以及IL-10的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組 （t=8.206、15.263、7.718，P=0.023、0.000、0.027）， 觀察組患者血漿中的 VEGF濃度顯著低于對(duì)照組（t=-8.110，P=0.009），組間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.2 觀察組患者的不同臨床特征中細(xì)胞因子的表達(dá)差異性 男性肺癌患者的VEGF濃度顯著高于女性患者（t=18.001，P=0.000），差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Th1、Th2 型細(xì)胞因子以及 VEGF 在不同年齡段的患者血漿表達(dá)差別不大（P>0.05）；臨床III/IV期患者血漿中的IL-8表達(dá)水平顯著低于I/II期表達(dá)水平（t=9.546，P=0.001），差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余細(xì)胞因子在病情不同程度的分期上差別不大（P>0.05）。見表3。

2.3 肺癌患者血漿細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性 肺癌患者中，IFN-γ的表達(dá)和NSE、糖類抗原CA125以及腫瘤特異生長因子呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 （r=0.164、0.156、0.189，P=0.039、0.032、0.021）；IL-6 濃度越高，NSE、CA125 以及腫瘤特異生長因子水平也越高,其關(guān)系為正相關(guān)，系數(shù)為（r=0.266、0.244、0.400，P<0.001）；IL-8 的表達(dá) NSE、糖類抗原CA125以及腫瘤特異生長因子呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為（r=0.302、0.299、0.342，P<0.001）；IL-10的表達(dá)和糖類抗原CA125呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為（r=0.192，P<0.001）；VEGF 和腫瘤特異生長因子為正相關(guān)，系數(shù)（r=0.287，P=0.001）。 見表 4。

表2 兩組患者血漿中相關(guān)因子表達(dá)水平（，n）

表2 兩組患者血漿中相關(guān)因子表達(dá)水平（，n）

組別 例數(shù)IL-2 Th1型IFN-γ IFN-a IL-12 IL-6 Th2型IL-8 IL-10VEGF觀察組對(duì)照組t值P值114 92 2.65±0.80 6.93±4.20-12.524＜0.001 5.52±1.82 2.50±1.90 9.224 0.001 10.52±9.20 7.01±3.21 7.887 0.031 4.03±2.95 3.95±0.84 2.084 0.712 4.36±1.52 2.84±1.23 8.206 0.023 13.20±3.20 2.23±1.02 15.263＜0.001 3.85±0.74 2.01±0.05 7.718 0.027 123.62±28.63 259.6±100.21-8.110 0.009

3 討論

雖然目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)Ψ伟┲委焄6]的進(jìn)展已經(jīng)非常之大，其中主要為手術(shù)治療、放化療等，但是肺癌患者的預(yù)后仍然不理想，5年后生存率極低[7]，極大的威脅著人類的健康。相關(guān)研究表示[8]，機(jī)體內(nèi)的免疫功能失調(diào)會(huì)在非小細(xì)胞癌的發(fā)展過程中出現(xiàn)一定的作用。機(jī)體中的主要效應(yīng)細(xì)胞為CD4+T淋巴細(xì)胞，分為Th1和Th2兩種，Th1主要分泌IL-2、IFN-γ或TNF-β等細(xì)胞因子，Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6 或 IL-10 等細(xì)胞因子[9]。 一般情況下兩種細(xì)胞因子會(huì)維持著整個(gè)機(jī)體的相對(duì)平衡，兩者相互調(diào)節(jié)對(duì)方的活動(dòng)和發(fā)展方向,但是兩者若出現(xiàn)失衡，體積的免疫功能也隨著出現(xiàn)失調(diào)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起腫瘤的發(fā)生。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10]：聯(lián)合檢查非小細(xì)胞癌患者的血漿中IL-4和IL-10的濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康者,而Th1型的IL-2、IL-12等因子均顯著低于正常人,足以說明Th1和Th2的失衡和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

表3 觀察組患者的不同臨床特征中細(xì)胞因子的表達(dá)差異性（，n）

表3 觀察組患者的不同臨床特征中細(xì)胞因子的表達(dá)差異性（，n）

注：組間進(jìn)行比較，*P<0.05。

項(xiàng)目 IL-2 IFN-γ IFN-a IL-12P40性別男女年齡分期分型≥60歲＜60歲I/II期III/IV期腺癌鱗癌小細(xì)胞癌其他2.55±0.87 2.60±0.84 2.50±0.78 2.61±0.80 2.75±0.86 2.69±0.84 2.69±0.94 2.46±1.03 2.74±1.30 2.56±1.14 3.26±7.12 3.50±7.09 3.74±2.63 3.23±2.95 5.01±3.32 5.85±3.98 5.69±3.36 6.03±4.02 6.23±4.12 6.51±4.09 11.63±10.20 10.89±10.03 10.80±7.20 10.21±7.69 9.32±8.69 10.49±9.25 10.69±9.17 11.62±10.63 10.32±9.85 11.03±9.01 3.98±3.79 4.16±3.54 4.30±2.96 4.52±3.16 5.48±2.96 4.09±3.02 4.30±2.99 4.58±3.69 4.65±3.62 3.98±2.47 IL-6 IL-8 IL-10 VEGF 2.96±2.65 2.89±2.24 2.87±1.03 2.93±1.56 2.98±0.74 2.93±0.84 2.98±0.96 3.02±0.99 3.23±1.03 2.80±0.89 14.95±3.26 12.98±3.62 11.36±3.14 12.20±3.26 2.96±2.15*15.36±4.85*7.69±4.63 8.03±4.50 7.78±4.47 7.59±4.09 2.78±1.75 2.71±1.80 2.79±1.96 2.74±1.74 3.05±2.03 2.63±1.79 2.78±1.78 2.72±2.01 2.79±1.89 2.65±1.87 622.59±321.47*225.19±192.52*302.25±250.47 299.16±248.14 400.63±295.63 398.59±277.41 512.63±253.64 520.14±245.26 513.67±250.69 505.75±239.89

表4 肺癌患者血漿細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合生長因子，是一種“保守型”的二聚體糖蛋白，與很多疾病的診治息息相關(guān)[11]。其具有以下功能：1.刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；2.導(dǎo)致病理性血管生成；3.最強(qiáng)的血管滲透劑[12-13]。

段民新[14]等研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者的IL-12水平較健康患者顯著降低（P<0.05）；張霞琴[15]等指出,肺癌患者外周血的中TNF-a濃度相對(duì)于健康人來說較高,而進(jìn)展期的肺癌患者的TNF-a濃度更高。穆贏海[16]證實(shí)了，高表達(dá)水平的IL-6和非小細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后有一定的相關(guān)性，病情晚期的患者，其血清中的IL-6濃度顯著升高,本研究與之相似。本研究可以看出Th1型中，觀察組血漿中的IFN-γ、IFN-a 濃度均顯著高于對(duì)照組 （P＜0.0 5），而觀察組血漿中IL-2表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組組間（P＜0.05）；Th2 型中，觀察組患者血漿中的 IL-6、IL-8以及IL-10濃度均高于對(duì)照組，肺癌患者血漿中的VEGF濃度顯著低于健康人，組間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；男性肺癌患者的VE GF濃度顯著高于女性患者（t=18.001，P=0.000），說明了肺癌患者內(nèi)存在著Th1型細(xì)胞因子向Th2型細(xì)胞因子漂移的現(xiàn)象,由此證實(shí)了肺癌患者機(jī)體內(nèi)的兩種細(xì)胞因子出現(xiàn)失衡,和肺癌的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。而觀察組患者血漿中的VEGF表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果有所差別[17]。表2中可以看出男性肺癌患者的VEGF濃度顯著高于女性患者（t=18.001，P=0.000），臨床 III/IV期患者血漿中的IL-8表達(dá)水平顯著低于I/II期表達(dá)水平（t=9.546，P=0.001），其余細(xì)胞因子在病情不同程度的分期上差別不大（P＞0.05），進(jìn)一步證實(shí)了Th1向Th2漂移的程度和臨床分期具有相關(guān)性（P＜0.05），和其余臨床特征無明顯相關(guān)性。表3中可以看出 IFN-γ 、IL-6、IL-8分別與 NSE、CA125以及腫瘤特異生長因子呈正相關(guān)；IL-10的濃度越高，CA125水平也越高,兩者呈正相關(guān)；VEGF的表達(dá)和腫瘤特異生長因子呈正相關(guān),提示了聯(lián)合檢測相關(guān)細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物,能夠有效的提高對(duì)肺癌患者的診斷、預(yù)后評(píng)估等方面的準(zhǔn)確率。

綜上所述，研究通過聯(lián)合檢查患者機(jī)體的細(xì)胞因子和常見腫瘤標(biāo)志物,同時(shí)分析了兩者之間的相關(guān)性,可以有效的了解機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)的情況,并且有可能為肺癌的免疫治療提供有益的治療方案。