余曉慧 ，劉靜 ，鄔艷 ，陳晶

（1.瑞昌市人民醫(yī)院，江西 九江 332200；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；3.南昌市東湖區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330006；4.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006）

腦脊液（CSF）是存在于腦室和蛛網(wǎng)膜下腔的一種無(wú)色透明液體，對(duì)腦和脊髓具有保護(hù)、支持和營(yíng)養(yǎng)等多種功能[1]。正常CSF中存在著蛋白質(zhì)、葡萄糖、氯化物和酶類等化學(xué)物質(zhì)，各類成分含量保持相對(duì)穩(wěn)定,以保證CSF發(fā)揮正常的生理功能[2]。經(jīng)典的CSF蛋白質(zhì)包括總蛋白 （TP）和微量蛋白（mALB），TP常用于輔助診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、神經(jīng)根病變及椎管內(nèi)梗阻性腦病,也常用于鑒別細(xì)菌性與非細(xì)菌性感染[3]，而mALB主要經(jīng)血腦屏障滲透而來(lái)，被認(rèn)為是評(píng)價(jià)血腦屏障完整性的理想?yún)?shù)[4]，因此CSF中TP和mALB的準(zhǔn)確檢測(cè)有重要臨床價(jià)值[5]。但在檢驗(yàn)工作中，我們發(fā)現(xiàn)有部分CSF標(biāo)本由于蛛網(wǎng)膜下腔出血或穿刺導(dǎo)致黃變（輕微溶血）或溶血現(xiàn)象，由于CSF標(biāo)本不易獲取，檢驗(yàn)科往往會(huì)做讓步檢驗(yàn),但溶血對(duì)CSF標(biāo)本中的蛋白成分檢測(cè)的影響如何,尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究中,我們依據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 416-2013《干擾實(shí)驗(yàn)指南》對(duì)溶血干擾CSF蛋白的檢測(cè)進(jìn)行干擾研究，探討不同溶血程度對(duì)CSF蛋白檢測(cè)結(jié)果的影響，為檢驗(yàn)人員更好地了解檢驗(yàn)結(jié)果，為臨床提供更準(zhǔn)確的解釋提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為其他CSF檢測(cè)項(xiàng)目的干擾研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 研究對(duì)象 選擇TP和mALB濃度分別接近正常生物參考區(qū)間上限的CSF標(biāo)本各1例,外觀清亮，經(jīng)Sysmex全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)CSF標(biāo)本中血紅蛋白（Hb）含量為0g/L，此為基礎(chǔ)樣品。同時(shí)收集同一病人的血常規(guī)標(biāo)本備用。

1.1.2 主要儀器和試劑 Beckman AU5400全自動(dòng)生化分析儀，CSF-TP檢測(cè)試劑盒為中山標(biāo)佳生物科技有限公司的尿液總蛋白檢測(cè)試劑盒,方法為鄰苯三酚紅鉬（PRM）比色法；CSF-mALB檢測(cè)試劑盒為DiaSys公司微量白蛋白測(cè)定試劑盒,方法為免疫透射比濁法,兩者均使用配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。Sysmex XE-2100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，使用原裝配套試劑和質(zhì)控品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 干擾物（溶血）原液的制備 取上述血常規(guī)標(biāo)本2ml，3000g離心3min，小心吸出上層血漿棄去，剩下約1ml紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移到干凈試管中,加入5ml生理鹽水輕輕顛倒混勻,充分洗滌紅細(xì)胞,3000g離心3min,小心吸出上層液體棄去，繼續(xù)將紅細(xì)胞以同樣的方法清洗5次,對(duì)最后一次上清液進(jìn)行TP和mALB濃度檢測(cè),直到其濃度<0.1mg/L為止,如不合格則繼續(xù)進(jìn)行清洗直到合格為止。清洗結(jié)束后，加入200μl蒸餾水混勻制得紅細(xì)胞懸液，以注射器反復(fù)吹打徹底溶解紅細(xì)胞，3000g離心3min吸取上層溶血液體即為干擾物原液，以Sysmex XE-2100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)Hb濃度并記錄。此處需注意溶解紅細(xì)胞要徹底才能獲得高Hb濃度的干擾物原液。

1.2.2 干擾物劑量效應(yīng)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 干擾物高實(shí)驗(yàn)濃度樣品與低實(shí)驗(yàn)濃度樣品制備 見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品制備方法

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)樣品系列的制備 將上述制得的干擾物高實(shí)驗(yàn)濃度樣品與低實(shí)驗(yàn)濃度樣品定量混合，可得到干擾物濃度介于兩樣品之間的一系列實(shí)驗(yàn)樣品。確定線性劑量相關(guān)關(guān)系時(shí)需要5個(gè)濃度水平。見(jiàn)表2。

表2 干擾物不同濃度系列樣品的制備

1.2.2.3 TP和mALB測(cè)定 用Beckman AU5400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)上述樣品中TP和mALB濃度，儀器質(zhì)控在控狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有樣品一次檢測(cè)完成，所有操作均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程進(jìn)行。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，將上述系列樣品按升序（1、2、3、4、5）進(jìn)行第一次檢測(cè)，再按降序（5、4、3、2、1）進(jìn)行第二次檢測(cè)，再按升序進(jìn)行第三次檢測(cè)。記錄結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 計(jì)算最低干擾物濃度樣品的測(cè)定均值，分別用5個(gè)水平樣品的測(cè)定均值減去此均值得出不同濃度干擾物的干擾效果。以干擾效果為Y值，干擾物濃度為X值，繪出干擾物劑量相關(guān)曲線。根據(jù)曲線趨勢(shì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如果為線性相關(guān)，則計(jì)算線性回歸方程；如果為非線性相關(guān)，則采用非線性回歸分析得出相應(yīng)的最佳擬合曲線與數(shù)學(xué)模型。根據(jù)回歸方程或數(shù)學(xué)模型可推斷出在評(píng)價(jià)范圍內(nèi)任意干擾物濃度所引起的干擾效應(yīng)值。

2 結(jié)果

2.1 干擾物（溶血）原液中Hb濃度 本次實(shí)驗(yàn)選取了2名患者的CSF標(biāo)本，分別用于研究溶血對(duì)CSF中TP和mALB的干擾效應(yīng)。以Hb濃度來(lái)表示標(biāo)本的溶血程度，標(biāo)本中Hb濃度越高則表示標(biāo)本溶血越明顯。用此2位病人的血常規(guī)標(biāo)本分別制作了干擾物（溶血）原液，TP的干擾物原液中Hb濃度為201g/L，mALB的干擾物原液中Hb濃度為175g/L。

2.2 干擾效果 用Beckman AU5400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品系列,結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3 CSF-TP干擾物濃度及干擾效果

表4 CSF-mALB干擾物濃度及干擾效果

2.3 干擾效果的回歸分析 以干擾效果為Y值，干擾物濃度為X值，繪出干擾物劑量相關(guān)曲線。溶血程度與CSF中TP檢測(cè)的干擾效果為線性相關(guān)、正向干擾，溶血程度越高,干擾越明顯,對(duì)mALB的干擾效果不明顯,溶血程度與干擾效果之間無(wú)相關(guān)性,見(jiàn)圖 1、圖 2。

圖1 溶血對(duì)CSF中TP檢測(cè)的干擾效果

圖2 溶血對(duì)CSF中mALB檢測(cè)的干擾效果

3 討論

近年來(lái)隨著檢驗(yàn)技術(shù)的快速發(fā)展,大部分檢驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，檢驗(yàn)過(guò)程實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)控制，這大大提高了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。也正是因?yàn)槿绱?，檢驗(yàn)前因素如標(biāo)本溶血、脂濁和黃疸等對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的干擾也越來(lái)越凸顯,因此,充分研究并了解檢驗(yàn)前因素對(duì)檢驗(yàn)的干擾作用有助于檢驗(yàn)人員對(duì)結(jié)果做出正確的判斷,并為臨床提供可靠的診斷依據(jù)[6]。

標(biāo)本溶血是檢驗(yàn)前干擾因素中最常見(jiàn)的一種[7,8]，其影響檢測(cè)結(jié)果的機(jī)制主要有三方面：⑴紅細(xì)胞內(nèi)的高濃度物質(zhì)如K、LDH、AST等隨溶血進(jìn)入待檢標(biāo)本后，使相應(yīng)物質(zhì)的濃度增加；⑵血紅蛋白本身吸光度的干擾;⑶某些紅細(xì)胞成分對(duì)化學(xué)反應(yīng)的干擾[9]。PRM比色法檢測(cè)CSF-TP的原理為鄰苯三酚紅與鉬酸鹽結(jié)合形成紅色復(fù)合物,在酸性條件下，該復(fù)合物與總蛋白結(jié)合，從而使蛋白的最大吸收波長(zhǎng)由467nm轉(zhuǎn)換為598nm,并產(chǎn)生藍(lán)紫色,儀器根據(jù)吸光度的變化計(jì)算CSF-TP的含量[10]。Hb在體內(nèi)除原始形態(tài)外,還存在氧合血紅蛋白和高鐵血紅蛋白等形式,吸收光譜覆蓋540nm～630nm[11-13]，造成PRM比色法在598nm處的吸光度增加，進(jìn)而錯(cuò)誤地表現(xiàn)為待測(cè)物濃度增加,而在本研究中則表現(xiàn)為溶血對(duì)CSF-TP檢測(cè)的正干擾,且干擾幅度極大，每克Hb的干擾效果遠(yuǎn)超衛(wèi)健委推薦的允許總誤差10%，因此溶血標(biāo)本不適合進(jìn)行CSF-TP的檢測(cè)。應(yīng)用免疫透射比濁法檢測(cè)CSF-mALB的原理是羊抗人白蛋白抗體和樣品中的白蛋白進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，用透射比濁檢測(cè)吸光度的變化反映白蛋白的濃度。本文結(jié)果顯示，低濃度的Hb對(duì)免疫透射比濁法檢測(cè)CSF-mALB基本無(wú)干擾,這與試劑說(shuō)明書所宣稱的一致（Hb≤2.5g/L時(shí)無(wú)干擾），也與此前的文獻(xiàn)報(bào)道相一致[14]，當(dāng)Hb濃度＞4g/L時(shí),本結(jié)果顯示其干擾效果也不明顯，但仍有待其他研究的進(jìn)一步驗(yàn)證。該反應(yīng)使用的檢測(cè)波長(zhǎng)為415nm，而且抗原抗體的反應(yīng)相對(duì)特異性高，可能是mALB檢測(cè)受Hb影響小的主要原因,因此臨床上對(duì)于有溶血的CSF標(biāo)本可以進(jìn)行mALB的檢測(cè)。

臨床上針對(duì)溶血標(biāo)本的處理有多種方法，如增加副波長(zhǎng)檢測(cè)、Hb單克隆抗體、統(tǒng)計(jì)學(xué)消除等，但這都是標(biāo)本采集后處理，不僅操作繁瑣，而且有些干擾是不可消除的[15]。對(duì)此，檢驗(yàn)工作人員應(yīng)了解溶血對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目的干擾作用,為臨床提供正確的解讀，同時(shí)也應(yīng)積極與醫(yī)護(hù)溝通，著重培訓(xùn)正確的采樣程序，從源頭減少溶血標(biāo)本的產(chǎn)生，這樣才能切實(shí)提高實(shí)驗(yàn)室水平，保證檢驗(yàn)質(zhì)量。