梅琳琳，王雅莉，李紅娟，張慧

（鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450007）

近年來(lái)臨床上卵巢癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯上升，同時(shí)卵巢癌患者的生存預(yù)后指標(biāo)并無(wú)明顯的改善。流行病學(xué)研究證實(shí)，卵巢癌的平均發(fā)病率維持在252~727/10萬(wàn)人左右,在具有卵巢惡性上皮性腫瘤家族史的女性群體中,卵巢病變的風(fēng)險(xiǎn)可進(jìn)一步上升[1]。腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)，能夠影響上皮細(xì)胞的早期增殖調(diào)控、癌細(xì)胞的粘附能力或者浸潤(rùn)能力,進(jìn)而參與到生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生過(guò)程。人類軟骨糖蛋白 （YKL-40）是重要的分泌型糖蛋白，其能夠通過(guò)結(jié)合細(xì)胞膜上的糖蛋白配體，激活細(xì)胞膜內(nèi)的多種信號(hào)通路,導(dǎo)致上皮細(xì)胞的增殖速度的改變[2,3]?；A(chǔ)方面的研究證實(shí)，YKL蛋白能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞的分化成熟障礙,導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)于基底膜組織的突破風(fēng)險(xiǎn)明顯的增加[4]。少量的研究探討了YKL-40蛋白在子宮內(nèi)膜癌或者甲狀腺癌等中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)YKL-40表達(dá)濃度的上升是促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生及臨床預(yù)后惡化的重要風(fēng)險(xiǎn)[5]，但在卵巢癌中的分析研究不足。為了揭示卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，分析YKL-40蛋白在促進(jìn)卵巢癌發(fā)生過(guò)程中的作用，本次研究分析了YKL-40蛋白在卵巢癌細(xì)胞SKOV3中的表達(dá)情況及其對(duì)于SKOV3細(xì)胞的侵襲、化療敏感性等的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 卵巢癌細(xì)胞SKOV-3，已確認(rèn)表達(dá)YKL-40的人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87作為陽(yáng)性對(duì)照，均購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3 構(gòu)建YKL-40過(guò)表達(dá)細(xì)胞 采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取和純化EPMI重組質(zhì)粒及YKL-40質(zhì)粒，測(cè)定濃度，將人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87或者卵巢癌上皮細(xì)胞SKOV3鋪于六孔板上，隔日更換培養(yǎng)瓶PRIM60，在細(xì)胞融合度為75%~80%時(shí)加入脂質(zhì)體和構(gòu)建的質(zhì)粒，并進(jìn)行篩選，定期更換培養(yǎng)基清除死亡的細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞遷移試驗(yàn) 采用細(xì)胞刮將上室內(nèi)細(xì)胞輕輕刮去,采用磷酸鹽緩沖液洗兩次,每次3min，行多聚甲醛固定液固定,結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察，隨機(jī)選3個(gè)視野,計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，根據(jù)每個(gè)區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量計(jì)算細(xì)胞侵襲能力。

1.5 Western blot檢測(cè) 采用細(xì)胞裂解液裂解收集的細(xì)胞集落,裂解蛋白與上樣緩沖液以5：1的濃度相互混合，80~100℃煮沸5min。根據(jù)不同的蛋白分子量水平,配制并灌注相應(yīng)的12%的分離膠和5%的濃縮膠,按15g／孔蛋白量進(jìn)行組織蛋白的上樣，進(jìn)行SDS．PAGE電泳,電泳后根據(jù)條帶進(jìn)行切膠,半濕法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，BSA蛋白封閉2h，加入含 10%BSA一抗及二抗（1：1000），磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5min，進(jìn)行曝光及膠片弧度的讀取。

1.6 CCK-8試驗(yàn) 在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μl/孔），向每孔加入 10μl CCK8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1~4h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度，若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1%w/v SDS溶液，24h內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料采用（)表示，兩組間比較使用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SKOV-3和U87細(xì)胞YKL-40蛋白表達(dá)比較SKOV-3細(xì)胞YKL-40蛋白表達(dá)量明顯低于U87細(xì)胞（P＜0.05）,可見(jiàn) SKOV-3細(xì)胞基本不表達(dá) YK L-40蛋白。見(jiàn)表1和圖1。

2.2 YKL-40過(guò)表達(dá)對(duì)SKOV-3細(xì)胞遷移影響YKL-40過(guò)表達(dá)組SKOV-3細(xì)胞遷移數(shù)明顯高于對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2和圖2。

表1 SKOV-3和U87細(xì)胞YKL-40蛋白表達(dá)比較（，n=6)

表1 SKOV-3和U87細(xì)胞YKL-40蛋白表達(dá)比較（，n=6)

細(xì)胞 YKL-40蛋白表達(dá)SKOV-3 U87 t P 0.004±0.001 0.986±0.032-75.132 ＜0.05

圖1 Wetern blot檢測(cè)圖

表2 對(duì)照組和YKL-40過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)比較（，n=6)

表2 對(duì)照組和YKL-40過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)比較（，n=6)

分組 SKOV-3細(xì)胞遷移數(shù)（個(gè)）對(duì)照組YKL-40過(guò)表達(dá)組t P 104.39±20.03 270.31±25.60-12.503 ＜0.05

圖2 細(xì)胞遷移圖

2.3 YKL-40過(guò)表達(dá)抑制順鉑對(duì)SKOV-3細(xì)胞殺傷作用 在 1μg/L、2.5μg/L、5μg/L 順鉑下，YKL-40過(guò)表達(dá)組SKOV-3細(xì)胞抑制率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表 3。

表3 不同順鉑作用下兩組細(xì)胞抑制率比較（，n=6)

表3 不同順鉑作用下兩組細(xì)胞抑制率比較（，n=6)

分組 1μg/L順鉑下細(xì)胞抑制率（%）對(duì)照組YKL-40過(guò)表達(dá)組2.5μg/L順鉑下細(xì)胞抑制率5μg/L順鉑下細(xì)胞抑制率t p 17.82±3.32 3.21±1.01 10.313＜0.05 30.03±3.50 17.20±2.78 7.031＜0.05 67.98±4.10 45.59±3.89 9.704＜0.05

3 討論

基因突變、遺傳及環(huán)境的交互作用等，均能夠增加卵巢惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。而現(xiàn)階段臨床上卵巢癌的總體治療效果較為局限,包括卵巢癌根治性手術(shù)、卵巢癌腫瘤減滅術(shù)及術(shù)后放化療等措施,雖然能夠減輕卵巢腫瘤患者的高腫瘤負(fù)荷表現(xiàn),改善患者短期內(nèi)的臨床癥狀,但其治療后的病情緩解率水平或者遠(yuǎn)期的生存預(yù)后改善程度并不理想[6]。一項(xiàng)囊括了多中心的隨機(jī)分析研究揭示了卵巢癌的治療預(yù)后轉(zhuǎn)歸,發(fā)現(xiàn)卵巢癌的三年生存率不超過(guò)38%，同時(shí)無(wú)進(jìn)展生存期不超過(guò)28個(gè)月[7]。而本次研究對(duì)于卵巢癌上皮性細(xì)胞株SKOV3的分析，具有下列幾個(gè)方面的作用：⑴能夠?yàn)槁殉舶┥掀ぜ?xì)胞的發(fā)病病因進(jìn)行進(jìn)一步的揭示和闡述，從而為卵巢癌的免疫靶向治療提供作用靶點(diǎn)；⑵能夠?yàn)槁殉舶╈o脈化療耐藥的機(jī)制進(jìn)行分析，為提高卵巢癌的化療敏感性提供依據(jù)。

YKL-40是重要的膜分泌型蛋白，其結(jié)構(gòu)上具有多重重復(fù)的絲氨酸磷酸化結(jié)構(gòu)，能夠穩(wěn)定結(jié)合細(xì)胞膜上的糖蛋白結(jié)構(gòu)，激活細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的三磷酸成分，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)第二信使的上調(diào)，干預(yù)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。YKL-40蛋白能夠在激活細(xì)胞內(nèi)多種的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路上發(fā)揮作用，提高M(jìn)APK及AKT信號(hào)通路的激活程度，提高細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄基因的活性[8]；基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究還證實(shí)，YKL-40蛋白能夠影響癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)于淋巴結(jié)及血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力的升高[9]；YKL-40還能夠?qū)е掳┘?xì)胞異型性的改變，影響腫瘤組織的分級(jí)程度[10,11]。部分研究揭示了YKL-40在乳腺癌等惡性腫瘤中的表達(dá)情況，認(rèn)為YKL-40的表達(dá)的上升是促進(jìn)乳腺癌臨床分期進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)因素[12]，但對(duì)于YKL-40與卵巢癌細(xì)胞SKOV3的關(guān)系研究較少。

在SKOV-3細(xì)胞中蛋白水平的分析可以發(fā)現(xiàn)，YKL-40蛋白的表達(dá)濃度較低，基本呈現(xiàn)出不表達(dá)的狀態(tài)，YKL-40的表達(dá)濃度的下降提示了在上皮性腫瘤細(xì)胞中，SKOV3可能并不參與到卵巢癌的早期發(fā)生過(guò)程，其后期的YKL-40蛋白的表達(dá)異?？赡芘c卵巢癌細(xì)胞在后續(xù)的增殖、分化障礙過(guò)程中的獲得性表達(dá)有關(guān)。但鑒于本次研究采用的是人腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為對(duì)照組，YKL-40蛋白的表達(dá)下降可能僅僅提示其表達(dá)濃度的相對(duì)性下降。在轉(zhuǎn)染了YKL-40蛋白后，卵巢癌上皮細(xì)胞SKOV3的侵襲能力明顯增強(qiáng)，提示了YKL-40蛋白對(duì)于卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特征的改變作用，薈萃國(guó)內(nèi)外的相關(guān)基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究，筆者認(rèn)為YKL-40對(duì)于卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力的改變主要與下列因素有關(guān)[13]：⑴YKL-40能夠提高卵巢癌細(xì)胞形成偽足的能力，導(dǎo)致癌細(xì)胞的變形能力及浸潤(rùn)能力的增加；⑵YKL-40能夠促進(jìn)卵巢癌上皮細(xì)胞間質(zhì)成分的分解，降低癌細(xì)胞的細(xì)胞間粘附能力。劉炎等[14]研究者也發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌浸潤(rùn)深度較深或者轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較高的人群中，卵巢癌腫瘤病灶組織中的 YKL-40表達(dá)濃度可平均上升27%以上，同時(shí)卵巢癌患者的臨床分期越晚、治療后的腫瘤復(fù)發(fā)率越高，YKL-40的表達(dá)濃度越高。卵巢癌的靜脈化療對(duì)于卵巢的治療預(yù)后意義重大，化療敏感性的下降能夠顯著增加腫瘤復(fù)發(fā)率和卵巢癌患者的病死率，導(dǎo)致患者臨床轉(zhuǎn)歸的惡化，本次研究中順鉑作用后的卵巢癌細(xì)胞均存在明顯的凋亡表現(xiàn)，但過(guò)度表達(dá) YKL-40的卵巢癌上皮細(xì)胞SKOV3其細(xì)胞凋亡比例明顯的下降，低于空白處理組SKOV3細(xì)胞，差異較為明顯，提示了YKL-40蛋白對(duì)于卵巢癌細(xì)胞的凋亡具有一定的抑制作用，其能夠降低SKOV3細(xì)胞的化療敏感性，這可能主要與 YKL-40對(duì)于卵巢癌細(xì)胞對(duì)于順鉑藥物的吸收速率的減慢、囊泡排泄化療藥物作用的增強(qiáng)等機(jī)制有關(guān)[15]。

綜上所述，卵巢癌SKOV-3細(xì)胞不表達(dá)YKL-40蛋白,而YKL-40可增強(qiáng)SKOV-3細(xì)胞遷移能力，降低SKOV-3細(xì)胞鉑類藥物的敏感性，值得進(jìn)一步研究。